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冠状动脉血流量降低,心肌血液供应受阻,导致心肌缺血,使心肌细胞供氧不足和代谢产物清除减少,造成心脏功能障碍甚至心肌细胞死亡。缺血后的血流恢复或输血反而可能加重心肌组织结构和功能破坏、甚至发生不可逆性损伤,造成心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI）。钙超载和活性氧增多引起的氧化应激、炎症反应、心肌纤维化与凋亡是MIRI主要的发病机制,研究改善这些病因的药物对抗MIRI具有积极的临床意义。咖啡酸苯乙酯（CAPE）是提取自蜂胶中的一种活性成分,属类黄酮类,有较好的抗氧化、抗炎、抗菌、抗肿瘤等药理活性。有报道类黄酮类物质如姜黄素可以通过上调沉默信息调节因子1（SIRT1）的表达,增加抗氧化能力起到改善MIRI作用,而同属黄酮类的CAPE是否能够激活SIRT1还未见报道。本课题组在CAPE的苯环对位引入硝基合成的咖啡酸对硝基苯乙酯（CAPE-pNO2）具有更强的促巨噬细胞的吞噬、抗血小板聚集、改善MIRI与糖尿病肾病损伤的作用。前期的研究表明硝基引入能增加MIRI的心肌组织中NO的含量,增加的NO是由硝基取代化合物直接代谢还是通过上调一氧化氮合酶（eNOS）加速生成而来还需进一步验证。本试验首次合成了CAPE的邻位硝基取代物——咖啡酸邻硝基苯乙酯（CAPE-oNO2）,并申报获得了中国发明专利。SYBYL模拟发现,邻位取代较对位取代具有更高的溶解度和更低的脏器毒性。本文选择CAPE-oNO2通过动物实验和细胞实验进一步探讨其对大鼠急性MIRI的作用及其可能的作用机制。动物实验:结扎SD大鼠左冠状动脉前降支造成心肌缺血,缺血30 min后再灌注2 h建立急性MIRI模型。结扎前30 min尾静脉注射给予SIRT1抑制剂烟酰胺（NAM）或eNOS抑制剂N-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）,而药物或溶剂（Vehicle）在结扎前15 min给予。将大鼠随机分为8组:空白对照（Control）组,缺血再灌注（IR）组,CAPE（0.1 mg/kg）组,CAPE-oNO2（0.1 mg/kg）组,NAM（1 mg/kg）+Vehicle组,NAM（1 mg/kg）+CAPE-oNO2（0.1 mg/kg）组,L-NAME（1 mg/kg）+Vehicle组,L-NAME（1 mg/kg）+CAPE-oNO2（0.1 mg/kg）组。首先通过TTC、HE、免疫组化和天狼星红染色分别测定心肌梗死面积、心脏组织病理学变化、心脏组织中TNF-α表达和胶原含量,再用试剂盒测定血清中心肌酶（HBDH,LDH,CK,CK-MB和IMA）水平与心脏组织中t-SOD、MDA、MPO、NO含量,然后通过免疫印迹（Western blot）法分析心肌组织中相关蛋白的表达。最后通过LC-MS方法分析CAPE和CAPE-oNO2在MIRI大鼠心肌组织中的代谢情况。结果表明,CAPE和CAPE-oNO2均可降低心肌梗死面积,改善缺血引起的心肌细胞排列紊乱,炎性细胞聚集等现象,并且能够显著降低心肌酶、MDA、MPO含量,TNF-α表达和胶原沉积,增加t-SOD活性和NO含量（P<0.05）。两者均可上调SIRT1和eNOS的表达,从而影响下游信号通路NF-κB,通过激活PGC-1α/Nrf2/SOD1系统缓解氧化应激;通过抑制IκB和P65磷酸化,下调TNF-α与IL-6表达,减少心肌组织炎症反应;通过下调TGF-β1,p-Smad2/3和Collagen的表达,减少心肌胶原沉积;通过上调Bcl-2和下调Bax的表达,减少心肌细胞的凋亡。值得注意的是CAPE-oNO2在抗氧化、抗炎症反应、抗纤维化和抗凋亡方面均表现出较CAPE更强的作用（P<0.05）,而当给予抑制剂后CAPE-oNO2改善MIRI的作用被明显抑制。二者的代谢产物与代谢方式均存在明显差异,CAPE-oNO2具有脱硝基代谢方式。细胞实验,采用氧糖剥夺的培养方法诱导H9c2心肌细胞缺氧,2h后正常条件下培养4h以复氧,建立细胞层面的MIRI模型。抑制剂在缺氧初期给予而药物或溶剂在复氧初期给予。取对数期细胞分为10组:Control组,缺氧/复氧（HR）模型组,CAPE（10,20,40μM）组,CAPE-oNO2（10,20,40μM）组,NAM（40μM）+CAPE-oNO2（40μM）组,L-NAME（40μM）+CAPE-oNO2（40μM）组。通过噻唑蓝（MTT）实验测定心肌细胞的存活率,AO染色和ROS染色分别考察细胞凋亡情况和细胞内活性氧水平。结果显示,HR处理后心肌细胞存活率明显降低（P<0.05）,而给予CAPE和CAPE-oNO2能有效提高细胞存活率,减少HR诱导的细胞凋亡和ROS产生,并且呈现剂量依赖性。Western blot结果显示CAPE和CAPE-oNO2组较HR组的SIRT1,eNOS,PGC-1α,SOD1和Bcl-2蛋白表达明显增加,而p-IκB/IκB,p-P65/P65和Bax明显降低（P<0.05）。同样地,在细胞层面CAPE-oNO2仍然表现出比CAPE更强抗MIRI的作用,而抑制剂的存在则一定程度上削弱了CAPE-oNO2的作用。动物和细胞实验均显示,CAPE和CAPE-oNO2能够有效缓解MIRI,可能成为临床改善和预防心肌损伤的候选药物。其作用机制可能为增加SIRT1和eNOS蛋白表达,影响NF-κB下游信号通路,产生抗氧化应激、抗炎症反应,抗潜在纤维化和抗凋亡的作用,通过多向调节发挥心肌保护作用。硝基取代能够明显提高CAPE的抗MIRI活性,其原因可能在于更大程度地上调SIRT1和eNOS从而影响NO含量并可能通过直接脱硝基代谢出NO,CAPE和CAPE-oNO2在心脏组织中的不同代谢产物与方式也可能是CAPE-oNO2效果优于CAPE的原因之一。