目的:通过PBS水提法制备水蛭提取液并分离纯化,高效液相色谱法（high performance liquid chromatography,HPLC）初步分析水蛭提取液各部位的稳定性;观察分离纯化后的水蛭提取液各部位对人视网膜色素上皮（retinal pigmented epithelial,RPE）细胞凋亡的影响;筛选水蛭提取液中促进RPE细胞凋亡的有效部位。通过检测水蛭提取液有效部位干预后RPE细胞中p38丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases,MAPK）的活性,进一步探讨水蛭提取液有效部位在p38 MAPK信号转导通路中促进RPE细胞凋亡的作用机理。超高效液相色谱-串联质谱联用技术（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS）检测水蛭提取液有效部位的化学成分组成,初步确定水蛭提取液促进RPE细胞凋亡的有效化学成分。RPE细胞异常增殖迁移是导致增生性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreoretinopathy,PVR）发生发展的主要原因,通过收集临床病例,采用光学相干断层成像（optical coherence tomography,OCT）检查等观察水蛭复方制剂“海昆化瘀片”在临床中对PVR的影响,进一步说明水蛭可能通过促进RPE细胞凋亡达到抗增殖作用。方法:第一部分1.水蛭提取液的制备与分离纯化:PBS水提法制备3批水蛭提取液,D-101大孔吸附树脂按极性大小分离纯化水蛭提取液,每批次6个水蛭提取液部位。2.HPLC初步分析水蛭提取液:HPLC分析分离纯化后水蛭提取液各部位的稳定性。3.水蛭提取液有效部位的初步筛选:取分离纯化后的6个水蛭提取液部位,每部位设置4个浓度,2mg/m L,0.5mg/m L,0.125mg/m L,0.03125mg/m L。不同浓度水蛭提取液各部位与RPE细胞共培养48h,流式细胞凋亡技术、RT-PCR、及western blot检测药物对RPE细胞凋亡的影响,初步筛选水蛭提取液有效部位及最佳浓度。所有对照组细胞仅在培养基添加PBS进行培养。4.水蛭提取液有效部位对RPE细胞凋亡的影响及相关机制研究:筛选出的水蛭提取液有效部位与RPE细胞共培养48h,流式细胞凋亡技术检测RPE细胞凋亡率,RT-PCR及western blot检测RPE细胞中凋亡蛋白Caspase3和p38 MAPK信号转导通路蛋白标记物表达情况。所有对照组细胞仅在培养基添加PBS进行培养。5.水蛭提取液有效部位的成分检测:UPLC-MS检测筛选出的水蛭提取液有效部位主要化学成分组成。第二部分回顾性临床病例对照研究。收集在2019年1月到2021年1月期间于成都中医药大学附属医院眼科就诊,病史资料完整,诊断为孔源性视网膜脱离,行视网膜脱离复位术（单纯巩膜外垫压+冷凝）,中医证型符合湿热瘀阻证的患者资料。治疗组为术后予以海昆化瘀片联合糖皮质激素干预30天;对照组为术后单纯予以糖皮质激素干预30天。分析纳入患者的一般资料,包括年龄、性别、眼别、术前血压、术眼患眼眼压（intraocular pressure,IOP）。通过OCT检查观察患者术后干预30天是否出现黄斑前膜,最佳矫正视力（best corrected visual acuity,BCVA）变化,散瞳后间接眼底镜检查视网膜有无再脱离,比较中医证候量表评分以及视功能损害患者生存质量量表（scale of life quality for diseases with visual impairment,SQL-VI）评分。结果:第一部分1.水蛭提取液的制备与分离纯化:水蛭提取液母液通过D-101大孔吸附树脂树脂被分离纯化为6个部位,按极性由大至小依次命名为水蛭提取液A（未吸附部位）、水蛭提取液B（超纯水洗脱部位）、水蛭提取液C（20%乙醇洗脱部位）、水蛭提取液D（50%乙醇洗脱部位）、水蛭提取液E（70%乙醇洗脱部位）、水蛭提取液F（90%乙醇洗脱部位）。2.HPLC初步分析水蛭提取液:HPLC分析3批水蛭提取液母液和分离纯化各部位,结果显示母液及各部位色谱峰出峰时间与峰面积大致相同,其中水蛭提取液F（90%乙醇洗脱部位）重复性最好。3.水蛭提取液有效部位的初步筛选:通过流式细胞凋亡检测、RT-PCR、western blot初步筛选,与对照组相比,0.125mg/m L的水蛭提取液F（90%乙醇洗脱部位）对RPE细胞凋亡作用最明显,Caspase3的m RNA以及蛋白含量表达最高。4.水蛭提取液有效部位对RPE细胞凋亡的影响及相关机制研究:0.125mg/m L的水蛭提取液F（90%乙醇洗脱部位）干预RPE细胞48h,与对照组相比,流式凋亡检测RPE细胞凋亡率为72.5967±9.8656,P=0.00<0.01,具有极显著统计学差异;与对照组相比,RT-PCR检测RPE细胞中Caspase3、p38MAPK蛋白m RNA表达明显升高,Caspase3为3.1200±0.9923,P=0.026<0.05,p38 MAPK为1.5333±0.2103,P=0.038<0.05,具有明显统计学差异;与对照组相比,western blot检测RPE细胞中Caspase3、p38 MAPK蛋白表达明显升高,Caspase3为4.2170±0.7067,P=0.003<0.01,具有极显著统计学差异,p38 MAPK为1.6322±0.0924,P=0.011<0.05,具有明显统计学差异。5.水蛭提取液有效部位的成分检测:UPLC-MS检测出水蛭提取液F中含有11种小分子化合物,根据文献研究以及二级离子碎片结合相对分子量大小初步推测化合物1可能为亚精胺。第二部分1.一般资料分析:分析纳入患者的年龄、性别、眼别、基线时间血压、基线时间患眼IOP,各组P>0.05,无明显统计学差异。2.OCT检查黄斑前膜出现率:术后30天OCT检查治疗组黄斑前膜出现率6.7%<对照组30%,P=0.042<0.05,具有明显统计学差异。3.BCVA:基线时间、术后30天治疗组BCVA（Log MAR）为0.9311±0.7201,0.5607±0.4769;对照组为1.0125±0.5604,1.0298±0.6707。基线时间治疗组与对照组BCVA（Log MAR）比较,P=0.627>0.05,无明显统计学差异;术后30天治疗组BCVA（Log MAR）小于对照组,P=0.003<0.01,具有极显著统计学差异;治疗组术后30天BCVA（Log MAR）小于基线时间,P=0.00<0.01,具有极显著统计学差异;对照组术后30天BCVA（Log MAR）大于基线时间,P=0.871>0.05,无明显统计学差异。4.视网膜再脱离情况:术后30天治疗组视网膜再脱离率（3.3%）<对照组（20%）,P=0.044<0.05,具有明显统计学差异。5.中医证候量表评分:基线时间、术后30天治疗组中医证候量表评分为6.93±2.48,4.87±2.24;对照组为6.77±1.83,6.23±2.01。基线时间治疗组与对照组中医证候量表评分比较,P=0.768>0.05,无明显统计学差异;术后30天治疗组中医证候量表评分小于对照组,P=0.016<0.05,具有明显统计学差异;治疗组术后30天中医证候量表评分小于基线时间,P=0.00<0.01,具有极显著统计学差异;对照组术后30天中医证候量表评分小于基线时间,P=0.009<0.01,具有极显著统计学差异。6.SQL-VI评分:基线时间、术后30天治疗组SQL-VI评分为164.93±44.99,200.03±50.87;对照组为155.00±41.92,164.87±47.87。基线时间治疗组与对照组SQL-VI评分比较,P=0.380>0.05,无明显统计学差异;术后30天治疗组SQLVI大于对照组,P=0.008<0.01,具有极显著统计学差异;治疗组术后30天SQLVI评分大于基线时间,P=0.00<0.01,具有极显著统计学差异;对照组术后30天SQL-VI评分大于基线时间,P=0.011<0.05,具有明显统计学差异。结论:1.采用PBS水提法提取水蛭,D-101大孔吸附树脂分离纯化水蛭提取液的方法较稳定。2.分离纯化后的水蛭提取液F（90%乙醇洗脱部位）经HPLC分析显示重复性与稳定性最好,化学成分组成较单一。3.0.125mg/m L的水蛭提取液F（90%乙醇洗脱部位）具有促进RPE细胞凋亡的作用,为水蛭提取液有效部位。4.0.125mg/m L的水蛭提取液F（90%乙醇洗脱部位）可能通过上调p38MAPK信号转导通路促进RPE细胞凋亡。5.UPLC-MS分析初步推测水蛭提取液有效部位中促进RPE细胞凋亡的化合物可能为亚精胺,还需进一步研究鉴定化合物结构式。6.水蛭复方制剂“海昆化瘀片”联合糖皮质激素进行干预可以一定程度影响视网膜脱离术后PVR的发生发展,其抗增殖机理可能为水蛭促进RPE细胞凋亡,需进一步验证。