肿瘤免疫逃逸的机制目前仍然不十分清楚,导致人们缺乏有效的肿瘤防治方法。因此,对于肿瘤免疫逃逸机制的阐明有望为肿瘤的防治提出新的指导或者方向。目前越来越多的实验与临床证据表明,慢性炎症与肿瘤的发生发展密切相关,但是,其详细的作用机制不甚了解。HMGB1是TLR4内源性配体,我们先前的研究结果证明肿瘤细胞表面表达的TLR4参与了肿瘤的免疫逃逸。在肺癌中,我们发现TLR4信号能促使人肺癌细胞释放大量免疫抑制性细胞因子,如TGF-β、VEGF、IL-8等,细胞因子作用于肿瘤细胞使其抵抗诱导凋亡,逃避机体的免疫攻击。对于结肠癌,TLR4信号也能通过活化小鼠结肠癌细胞CT26的ERK和NF-κB信号通路,促进MIP-3α的分泌,分泌出的MIP-3α继而通过趋化非成熟DC进入肿瘤周围参与肿瘤免疫逃逸。已有的临床研究提示癌症病人血清中的HMGB1高于正常人,而HMGB1是TLR4的内源性配体。那么,是否可能肿瘤患者血清中的HMGB1来自于肿瘤细胞,HMGB1通过作用于自身的TLR4促进肿瘤的免疫逃逸?在以上研究背景和假设的基础上我们选取了来源于人或小鼠各种组织的肿瘤细胞株作为研究对象。首先观察了肿瘤细胞分泌HMGB1情况,分析了分泌到胞外的HMGB1对肿瘤自身的效应,以及对HMGB1究竟通过怎样的机制促进肿瘤生长和免疫逃逸做了初步的探讨。研究结果发现相对于其它细胞株如肺癌细胞株3LL、黑色素瘤细胞株B16和乳腺癌细胞株4T1等,小鼠结肠癌细胞株CT26能高分泌HMGB1,我们用台盼蓝拒染法排除了其高分泌并不是由于细胞坏死释放HMGB1的原因。为了观察自分泌的HMGB1的生物学效应,我们用小RNA干扰了HMGB1的表达,转染siRNA 48小时后,用Western-blot检测了HMGB1的表达,发现HMGB1siRNA能明显下调HMGB1蛋白的表达,同时ELISA检测也表明siRNA也能下调HMGB1分泌,大概能下调30%-40%。结肠癌细胞高分泌IL-6和PGE2,而IL-6和PGE2是非常重要的调节多种细胞增殖、凋亡、迁移和浸润的细胞因子。所以我们用ELISA的方法检测了HMGB1 siRNA对结肠癌细胞CT-26分泌IL-6和PGE2的影响,结果发现,HMGB1 siRNA能下调IL-6的分泌,但不能下调PGE2的分泌。然后用重组的HMGB1刺激CT26细胞,发现与LPS相似,重组的HMGB1能显著促进IL-6和PGE2的分泌。我们先前的实验发现,TLR4能够诱导人肺癌细胞A549、小鼠结肠癌细胞CT26的凋亡抵抗,而HMGB1的受体较多,如TLR4、TLR2和RAGE等。那么HMGB1是否可能通过它的受体诱导结肠癌细胞CT26的凋亡抵抗呢?Annexin V/PI染色FACS分析表明,当HMGB1 siRNA干扰了CT26细胞HMGB1的表达时,CT26更易被奥沙利铂诱导凋亡。同时我们用重组的HMGB1处理CT26细胞8小时,CT26细胞则表现为对奥沙利铂的凋亡抵抗。之前的结果提示,坏死细胞释放的HMGB1能够促进SMMC-7721肝癌细胞的增殖,如果把CT26自分泌的HMGB1干扰掉之后,CT26细胞的增殖情况又是怎样?我们通过MTT法检测发现,转染HMGB1 siRNA之后,CT26细胞的增殖能力明显下降,BrdU掺入和PI染色发现S期的细胞数明显减少。同时用重组HMGB1处理细胞,发现重组HMGB1能通过增加S期细胞数促进CT26细胞的增殖。HMGB1能促进CT26细胞增殖和分泌IL-6、PGE2并诱导凋亡抵抗,那么其分子机制是什么?我们首先关注的是细胞因子的分泌,之前的结果提示PDTC (NF-κB特异性抑制剂)和LY294002 (Akt/PI3K特异性抑制剂)能够降低LPS诱导结肠癌细胞IL-6、PGE2生成和降低LPS诱导凋亡抵抗。于是我们也用各种信号通路的抑制剂处理CT26细胞,发现通过抑制ERK、NF-κB通路的活化能够部分抑制外源性HMGB1诱导CT26细胞分泌IL-6和PGE2。而HMGB1促进CT26增殖,诱导凋亡抵抗的具体分子机制还有待进一步研究。此外,雷帕霉素能够通过抑制Akt/IKKα/β/NF-κB信号通路,从而抑制LPS诱导结肠癌细胞自分泌IL-6和PGE2,所以我们试图用雷帕霉素抑制HMGB1的生物学效应,我们发现雷帕霉素也能部分抑制外源性HMGB1诱导CT26细胞分泌IL-6和PGE2。综述所述,我们证明结肠癌细胞能通过自分泌HMGB1促进其自身增殖和凋亡抵抗,促进其自身分泌细胞因子IL-6和PGE2从而介导免疫逃逸。本实验结果提示结肠癌细胞自分泌的HMGB1可能在免疫逃逸中起重要的作用。