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全反式视黄酸(all-trans-retinoic acid,at RA)是视黄酸的主要活化形式,由视黄醇在酶的作用下脱氢氧化而成,通过与视黄酸受体结合发挥生物学作用。已证实多种组织和器官有at RA合成相关酶和视黄酸受体的表达,at RA的作用不局限于视觉维持,对于细胞增殖和分化、机体生长和胚胎发育十分重要,影响免疫系统、神经系统、消化系统、呼吸系统和生殖系统的功能,并能够预防和治疗癌症。在生殖方面,at RA参与性别决定、精子形成和精子能量代谢,影响卵母细胞成熟、受精和胚胎早期发育等。现有文献表明,卵泡颗粒细胞是卵巢内视黄醇摄取的主要位点,at RA主要在颗粒细胞合成。卵泡颗粒细胞是卵泡结构的组成部分,主要功能为合成分泌激素和细胞因子等,通过参与优势卵泡的选择和卵泡的闭锁来调控卵泡发育。既然颗粒细胞是视黄醇的靶细胞并合成at RA,那么推测at RA可能影响颗粒细胞的功能。本研究以KK-1细胞系为模型,探索了at RA对小鼠卵泡颗粒细胞孕酮合成分泌的影响及作用机制以及at RA对小鼠卵泡颗粒细胞m RNAs和mi RNAs表达图谱的影响。主要研究内容和结果如下:1.小鼠卵泡颗粒细胞KK-1中视黄醇摄取转运、视黄酸合成相关基因及视黄酸受体的表达用q PCR检测KK-1细胞中视黄醇摄取转运相关蛋白STRA6、CRBP1、CRBP2,视黄酸合成相关酶ADH1、ADH2、ADH7、ALDH1A1、ALDH1A2、ALDH1A3,视黄酸受体RARα、RARβ、RARγm RNA的相对表达量。结果显示,以上m RNA均在KK-1细胞中表达。2.at RA对小鼠卵泡颗粒细胞KK-1孕酮合成和分泌的影响使用不同浓度的atRA(0μM、0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、30μM)处理KK-1细胞6h、12h、18h、24h,检测at RA对KK-1细胞活力和孕酮合成分泌的影响。结果显示,0.01μM、0.1μM、1μM、10μM的at RA处理KK-1细胞6h、12h、18h、24h均能显著提高细胞活力(P﹤0.05),其中0.1μM、1μM、10μM处理18h效果最佳,三个浓度间细胞活力无显著差异(P﹥0.05);与对照组相比,用0.1μM和1μM的at RA处理KK-1细胞18h,St AR m RNA表达量显著升高(P﹤0.05);用0.1μM、1μM、10μM at RA处理KK-1细胞6h、12h、18h、24h均能显著提高St AR蛋白表达量(P﹤0.05);0.1μM、1μM、10μM at RA处理KK-1细胞6h、12h、18h、24h,孕酮分泌量显著提高(P﹤0.05)。3.at RA对小鼠卵泡颗粒细胞KK-1 m RNAs和mi RNAs表达图谱的影响使用0.1μM at RA处理KK-1细胞18h,设置空白对照,检测m RNAs和mi RNAs表达图谱的变化并挑选差异表达的m RNA和mi RNA进行q PCR验证。m RNA测序结果显示,与对照组相比,at RA处理组有569个基因差异表达,其中433个基因上调,136个基因下调;选择表达上调的RARβ、VDR、CYP26B1、CD36、Paqr7、AK5和表达下调的BMP4、Ass1、Id1、Ssc5、Tle6、Nos2进行q PCR验证,结果与测序结果相符;mi RNA测序结果显示,与对照组相比,at RA处理组有81个mi RNA差异表达,其中上调34个,下调47个,选择表达下调的mi RNA-6900-5p、mi RNA-181c-3p、mi RNA-6945-3p、mi RNA-3109-5p进行q PCR验证,结果与测序结果相符。4.at RA通过c AMP-PKA-CREB通路对小鼠卵泡颗粒细胞KK-1孕酮合成分泌的影响利用at RA、c AMP激活剂(forskolin)和PKA抑制剂(H-89)处理KK-1细胞,检测CREB磷酸化水平及对孕酮合成分泌的影响。结果表明,与对照组相比,添加at RA、forskolin、at RA+forskolin显著提高CREB的磷酸化水平(P﹤0.05),而添加H-89、at RA+H-89显著降低了CREB的磷酸化水平(P﹤0.05);at RA、forskolin、at RA+forskolin显著提高St AR m RNA的水平(P﹤0.05),H-89,at RA+H-89显著降低了St AR m RNA的水平(P﹤0.05);forskolin、at RA+forskolin显著提高CYP11A1 m RNA的水平(P﹤0.05),H-89、at RA+H-89显著降低了CYP11A1 m RNA的水平(P﹤0.05);forskolin、at RA+forskolin极显著提高St AR蛋白水平(P﹤0.01),H-89、at RA+H-89显著降低了St AR蛋白水平(P﹤0.05);at RA、forskolin、at RA+forskolin极显著提高CYP11A1蛋白的水平(P﹤0.01),H-89,at RA+H-89显著降低了CYP11A1蛋白的水平(P﹤0.05);at RA、forskolin、at RA+forskolin极显著提高孕酮分泌水平(P﹤0.01),H-89、at RA+H-89显著降低了孕酮分泌水平(P﹤0.05)。5.at RA通过RAR对小鼠卵泡颗粒细胞KK-1孕酮合成分泌的影响用at RA、RAR拮抗剂(AGN193109)处理KK-1细胞,检测对孕酮合成分泌和CREB的磷酸化水平的影响。结果显示,与对照组相比,添加AGN193109、at RA+AGN193109显著降低St AR m RNA水平(P﹤0.05),添加at RA、AGN193109、at RA+AGN193109极显著降低CYP11A1 m RNA水平(P﹤0.01);添加AGN193109组、at RA+AGN193109组St AR和CYP11A1蛋白水平极显著降低(P﹤0.01);添加at RA组孕酮分泌水平极显著升高(P﹤0.01),而添加AGN193109组、at RA+AGN193109组孕酮分泌水平极显著降低(P﹤0.01);添加at RA组CREB磷酸化水平显著升高(P﹤0.05),而添加AGN193109、at RA+AGN193109组CREB磷酸化水平极显著降低(P﹤0.01)。综上所述,在小鼠卵泡颗粒细胞KK-1中,有视黄酸合成事件发生;at RA通过与RAR结合,激活c AMP-PKA-CREB通路,影响St AR和CYP11A1的表达,进而影响小鼠卵泡颗粒细胞KK-1孕酮的合成与分泌;at RA改变小鼠卵泡颗粒细胞KK-1中m RNAs和mi RNAs的表达图谱。