[研究背景与目的]随着对肿瘤发病机制认识的逐步深入,靶向调控在肿瘤发生发展中起关键作用的信号通路已在恶性肿瘤的治疗中占据重要地位。Hippo信号通路是近年来研究发现的能够协调细胞增殖、细胞分化和细胞死亡,调控细胞、组织生长的一个高度保守的生长控制信号通路。YAP和TAZ是其关键下游效应分子,非磷酸化状态的YAP可以转移入核,与TEAD/TEF家族和其他转录因子相互作用来调节靶基因的转录表达,发挥促进细胞增殖、抑制细胞凋亡的作用,最终影响器官的大小以及肿瘤的形成。大量研究证实,Hippo通路在肿瘤进程中扮演了重要角色。“周氏克金岩方”(来自国医大师周仲瑛教授)为临床抗肺癌的有效验方。课题组前期对该方已经展开了系列的研究,动物实验结果显示,该方能显著抑制裸鼠移植瘤生长。并且通过药化分离及高通量平台筛选,从该方中获取到了一批细胞毒性成分。分析发现,麦冬皂苷类化合物具有显著地抗肿瘤效应。针对抗癌效果较好的麦冬皂苷B(Ophiopogonin B, OP-B)做进一步研究,分析发现其对Hippo通路的交叉网络有显著调节作用。因此,本研究试图发现和阐明OP-B在调控Hippo通路及其系统网络的作用,为其临床肿瘤治疗提供强有力的实验依据。[实验内容]本文以发病率及死亡率居首位的非小细胞肺癌(Non-small-cell lung cancer, NSCLC)为病理模型,剖析OP-B对Hippo通路的调控作用。第一部分以YAP为指标考察OP-B对Hippo通路是否有调节作用。第二部分对可能与OP-B作用相关的Hippo通路的交叉网络进行分析,最终选择E-cadherin及其相关连接蛋白进行研究,利用Westernblot、细胞免疫荧光技术、免疫共沉淀实验及siRNA干扰等技术探究其在OP-B调节YAP、发挥抗肿瘤效应中的关系。第三部分则通过siRNA干扰实验和过表达实验最终验证了Hippo通路在OP-B发挥抗肿瘤效应中的重要地位。[研究结果]第一部分我们利用Westernblot检测药物对YAP和p-YAP(Ser127)蛋白表达的作用,发现OP-B能剂量依赖性地促进YAP的Serl27磷酸化蛋白的生成。细胞免疫荧光实验结果也发现OP-B能降低YAP入核细胞百分比。说明OP-B能抑制YAP的活化,促进YAP的Serl27磷酸化,限制YAP的入核。第二部分为了研究E-cadherin是否参与OP-B的抗肿瘤作用的发挥,我们分别通过诱导E-cadherin的表达和抑制E-cadherin的功能后检测OP-B对细胞活力的影响。结果发现,诱导E-cadherin的合成,OP-B对NCI-H460细胞增殖能力的抑制作用增强,而抑制E-cadherin的功能明显削弱了OP-B对NCI-H460细胞增殖能力的抑制作用。说明E-cadherin参与OP-B的抑制细胞增殖作用。而且发现OP-B能剂量依赖性地促进E-cadherin的表达,抑制β-catenin的表达,但是对α-catenin蛋白表达水平无明显作用。进一步通过免疫共沉淀实验、β-catenin siRNA干扰实验等发现,OP-B剂量依赖性地促进β-catenin与E-cadherin的结合；干扰β-catenin蛋白的表达后,YAP的Serl27磷酸化水平明显降低,YAP核内大量聚积,且阻断了OP-B的促进YAP磷酸化的作用。第三部分通过LATS1 siRNA干扰实验和构建稳定高表达YAP细胞株检测OP-B对YAP及NCI-H460细胞活力的影响,结果发现与干扰β-catenin的表达效应类似,干扰LATS1蛋白的表达后,阻断了OP-B的促进YAP磷酸化的作用,且过表达YAP削弱了OP-B的抑制细胞增殖作用。进一步验证了Hippo通路在OP-B发挥抗肿瘤效应中的重要作用。。[结论与意义]本研究结果表明,OP-B通过促进β-catenin与E-cadherin的结合,传递调控Hippo通路的信号,抑制YAP的活化,使其滞留在细胞质中,限制其核内相关基因的转录,从而发挥抑制细胞生长、抗肿瘤作用。研究中我们探讨了E-cadherin与Hippo通路之间的联系,从某种意义上,对于寻找新的抗肿瘤治疗靶点有积极意义。另外,本研究为后续进一步阐明OP-B的抑癌分子机制指明了方向,为其临床肿瘤治疗提供了强有力的实验依据。