【摘 要】
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本研究以雷州黑鸭为研究对象,对高低产品系的卵巢组织进行转录组测序,结果表明miR-205-x为差异表达的miRNA。使用q PCR、EDU、CCK-8、流式细胞术技术探究miR-205-x对雷州黑鸭颗粒细胞的增殖、凋亡的影响;使用q PCR、双荧光素酶实验、WB试验对VEGFA基因与miR-205-x的靶标关系验证;并对候选靶基因VEGFA与雷州黑鸭产蛋性状进行相关性分析;通过以上技术验证出对雷州
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本研究以雷州黑鸭为研究对象,对高低产品系的卵巢组织进行转录组测序,结果表明miR-205-x为差异表达的miRNA。使用q PCR、EDU、CCK-8、流式细胞术技术探究miR-205-x对雷州黑鸭颗粒细胞的增殖、凋亡的影响;使用q PCR、双荧光素酶实验、WB试验对VEGFA基因与miR-205-x的靶标关系验证;并对候选靶基因VEGFA与雷州黑鸭产蛋性状进行相关性分析;通过以上技术验证出对雷州黑鸭产蛋性能具有显著作用的miRNA与靶基因,为雷州黑鸭的分子育种奠定理论基础。（1）采用机械剪碎和Ⅱ型胶原酶消化相结合的方法对雷州黑鸭卵巢颗粒细胞进行分离、培养。半定量技术鉴定出标志基因FSHR在雷州黑鸭的卵巢组织和颗粒细胞中均有表达,免疫荧光技术鉴定出FSHR蛋白在颗粒细胞膜表面激发出红色荧光,综上本试验成功分离、培养、鉴定雷州黑鸭的卵巢颗粒细胞。（2）在雷州黑鸭颗粒细胞中转染miR-205-x mimics、inhibitor及其对应NC,使用q PCR技术检测增殖、凋亡标志基因表达量,结果表明转染miR-205-x mimics组增殖标志基因c-myc、CCND1、PCNA的m RNA表达量显著低于对照组（P＜0.05）,抗凋亡标志基因BCL-2的m RNA表达量mimics组极显著低于对照组（P＜0.01）,促凋亡标志基因Caspase3的m RNA表达量mimics组显著高于对照组（P＜0.05）;转染miR-205-x inhibitor组CCND1基因的m RNA表达量显著高于对照组（P＜0.05）,C-MYC、PCNA基因的m RNA表达量inhibitor组高于对照组但差异不显著（P＞0.05）,BCL-2基因的m RNA表达量inhibitor组极显著高于对照组（P＜0.01）,Caspase3基因的m RNA表达量inhibitor组低于对照组但差异不显著（P＞0.05）;EDU结果表明mimics组细胞阳性率低于对照组,inhibitor组阳性率高于对照组;CCK-8结果表明mimics组细胞增殖曲线低于mimics NC,inhibitor组细胞增殖曲线高于inhibitor NC;流式细胞术结果表明mimics组细胞凋亡率高于mimics NC,inhibitor组细胞凋亡率低于inhibtor NC;上述试验结果表明miR-205-x抑制雷州黑鸭颗粒细胞的增殖,促进颗粒细胞的凋亡。（3）通过Targetscan网站预测miR-205-x的候选靶基因之一为VEGFA,实时荧光定量结果表明miR-205-x mimics组VEGFA基因m RNA表达量极显著低于mimics NC（P＜0.01）,miR-205-x inhibitor组VEGFA基因的m RNA表达量极显著高于inhibitor NC（P＜0.01）;双荧光素酶报告基因试验表明mimics+WT组荧光活性显著低于对照组,mimics+MUT组荧光活性显著高于对照组;Western Blot结果表明mimics组VEGFA基因蛋白表达量低于对照组,inhibitor组VEGFA基因表达量高于对照组;上述试验结果表明miR-205-x可靶向抑制VEGFA基因的表达。（4）雷州黑鸭VEGFA基因的内含子4上存在8个SNP位点,对8个位点与产蛋性能相关性分析,结果表明位点I4-14004 G＞T的GT基因型个体开产蛋重显著高于GG型个体（P＜0.05）;对8个位点的单倍型与产蛋性能相关性分析,在开产日龄性状上,H1H3与H1H6、H2H5具有显著性差异（P＜0.05）;在开产蛋重性状上,H1H3与H4H6,H1H7与H2H3,H2H3与H4H6、H5H6,H3H5与H4H6均具有显著性差异（P＜0.05）;在300 d产蛋数性状上,单倍型H1H6与H2H3、H3H5差异显著,H2H3与H5H5差异显著,H3H5与H5H5差异显著（P＜0.05）,综合以上结果表明H1H6为最优单倍型,可筛选出低开产日龄、高产蛋量的个体,H1H6可作为雷州黑鸭选育过程中的一个分子标记。
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