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目的:1、建立不同来源猪苓药材粗多糖紫外吸收光谱(UV)、红外吸收光谱(IR)、高效凝胶渗透色谱(HPGPC)和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮-高效液相色谱(PMP-HPLC)指纹图谱,为猪苓药材的质量控制提供参考。2、对总多糖进一步分离纯化,以异硫氰酸荧光素(FTIC)为探针,对猪苓多糖进行荧光标记。建立Caco-2细胞单层模型,探讨猪苓多糖在肠道中的吸收特征。方法;1、购买11批不同来源猪苓药材,粉碎后过60目筛,以1:10(g:mL)料液比加水煎煮,水提液加入无水乙醇至乙醇终浓度为80%制备总多糖,Sevage法脱蛋白后冷冻干燥备用,采用苯酚硫酸法和考马斯亮蓝法分别测定猪苓粗多糖中的总糖含量和蛋白含量。2、采用UV、IR、HPGPC-RID、HPLC技术分析1 1批次的猪苓粗多糖,建立粗多糖的多重指纹图谱。采用Chempattern软件以夹角余弦法和相关系数法计算IR指纹图谱的相似度,并进行主成分分析。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012A版)”计算HPGPC指纹图谱和PMP衍生化后的HPLC指纹图谱的相似度。结合已知分子量葡聚糖标准品,确定猪苓多糖主要多糖分子量范围。建立PMP柱前衍生HPLC法,测定总多糖主要单糖组成和单糖含量,采用SPSS22.0软件进行聚类分析。4、采用DEAEE-sephose-Fast Flow离子交换层析和G-100凝胶柱层析对粗多糖进行分离纯化,制备目标多糖组分/均一多糖。通过HPGPC-RID色谱验证其纯度,测定其分子量,通过TFA(三氟乙酸)水解,PMP柱前衍生化HPLC分析其单糖组成。5、以FITC为荧光探针,采用末端胺化还原反应得到荧光多糖。建立Caco-2细胞单层模型,通过测定细胞电阻值Teer、碱性磷酸酶活性AKP、荧光素的渗透率来评价模型的完整性和紧密性。进行猪苓多糖在AP→BL,BL→AP两个方向的转运实验,采用荧光分光光度法进行定量分析,计算表观渗透系数Papp,外排比PDR和转运量。结果:1、11批猪苓粗多糖的总糖含量为430.031-608.492 mg/g,蛋白含量为15.059-37.608 mg/g。2、不同来源猪苓药材粗多糖HPGPC指纹图谱相似度大于0.80,11批样品具有相似的分子量分布,猪苓水煎液中粗多糖的分子量范围可分为5个级分:<10KDa;10-35KDa;35-150KDa;150-450KDa;450-5000KDa,主要多糖的分子量分布于450-5000KDa范围内。IR指纹图谱的平均R值为0.982;平均cos θ值为0.981,不同来源样品红外光谱具有很强的的相似性,结合主成分分析(PCA)能基本区分产地。单糖组成HPLC指纹图谱相似度均在0.94以上,聚类分析将11批猪苓多糖分为三类。S1、S2、S3、S4、S5、S6、S8 聚为一类,S7、S10、S11 聚为一类,S9 单独聚为一类,产地因素对多糖的单糖组成影响较小。样品单糖组成均为甘露糖、葡萄糖和半乳糖。11批多糖的单糖含量差异较大,甘露糖含量为1.571～8.771 mg/g、葡萄糖含量为26.072～132.194 mg/g、半乳糖含量为 3.420～36.593 mg/g。3、通过分离纯化获得PPS1-1、PPS2-1两种均一多糖,测定PPS1-1重均分子量2208.895KDa,PPS2-1重均分子量为3724.346KDa,单糖组成均为甘露糖、葡萄糖和半乳糖。4、以FITC为荧光探针,成功得到两种荧光标记的猪苓多糖,荧光取代度分别为0.058%、0.428%。Caco-2 细胞单层模型的电阻值>1500 Ω·cm2,AKP(AP/BL)>1,荧光素的渗透率<2%。PPP1-Tyr-FITC、PPP2-Tyr-FITC在膜两侧的累积转运量具有浓度和时间依赖性;在AP→BL侧的转运过程中,PPP1-Tyr-FITC的Papp小于1×10-6,PPP2-Tyr-FITC的Papp介于10×10-6-1×10-6之间,两者的外排率PDR均小于0.5。结论:不同来源的猪苓药材采用传统水煎工艺提取的总多糖中主要多糖分子量范围在450-5000KDa,单糖组成为甘露糖、葡萄糖和半乳糖。猪苓多糖的IR、HPGPC、HPLC指纹图谱具有较高的相似度,可作为猪苓多糖的鉴别依据,IR指纹图谱结合主成分分析可基本区分猪苓多糖产地。所建立的Caco-2细胞模型可用于研究药物的肠道吸收,PPP1-Tyr-FITC在肠道中属于难吸收药物,PPP2-Tyr-FITC属于中等吸收药物,小分子量多糖更容易被肠道吸收,猪苓多糖在肠道中的吸收大于外排。