【摘 要】
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热应激极大的损害了雄性动物的生殖能力。支持细胞是睾丸中具有重要功能的一种体细胞,容易受到热应激的损害。精氨酸作为一种功能性非必需氨基酸,在促进仔猪生长发育过程中必不可少,同时精氨酸及其代谢产物在细胞过程和信号传导中起重要作用。然而,尚不清楚精氨酸及其代谢产物是否参与了热应激诱导的睾丸支持细胞的凋亡。本试验利用体外热应激模型,旨在探究精氨酸是否参与热应激诱导的支持细胞的凋亡,并探讨精氨酸及其代谢物在
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（32072940和31672624）；
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热应激极大的损害了雄性动物的生殖能力。支持细胞是睾丸中具有重要功能的一种体细胞,容易受到热应激的损害。精氨酸作为一种功能性非必需氨基酸,在促进仔猪生长发育过程中必不可少,同时精氨酸及其代谢产物在细胞过程和信号传导中起重要作用。然而,尚不清楚精氨酸及其代谢产物是否参与了热应激诱导的睾丸支持细胞的凋亡。本试验利用体外热应激模型,旨在探究精氨酸是否参与热应激诱导的支持细胞的凋亡,并探讨精氨酸及其代谢物在调节热应激诱导支持细胞凋亡中的机制。本试验利用体外培养支持细胞的热应激模型,通过质谱多反应监测技术（MRM）进行氨基酸代谢物检测,寻找差异氨基酸。利用氨基酸的代谢分析并预测差异氨基酸与凋亡的关系。通过添加外源性氨基酸,运用qRT-PCR、ELISA、Western blotting、流式细胞仪对相关氨基酸的代谢酶和代谢物进行检测。结合质谱技术,确定相关氨基酸在支持细胞的代谢情况。最后添加相关氨基酸的代谢产物进一步验证其在热应激诱导支持细胞凋亡中的作用。试验结果如下:1.支持细胞在热处理后活性下降了42%（p<0.01）,细胞的凋亡率升高了134%。2.热处理后,支持细胞中氨基酸代谢物发生了显著的变化,包括谷氨酸,肌酸,氨基乙磺酸,氨基己二酸明显上调（p<0.01）,其中精氨酸水平下调了54.9%（p<0.01）,并且与精氨酸有关代谢物也发生了很大的变化,如:鸟氨酸含量显著升高了70%（p<0.01）,瓜氨酸含量下降了39.8%（p<0.05）,腐胺含量显著升高了103%（p<0.01）。3.热处理后,在精氨酸-NO代谢中,支持细胞的i NOS蛋白表达升高,NO含量升高了57%（p<0.01）,瓜氨酸含量下降了39.8%（p<0.05）。在精氨酸-精胺代谢途径中,与对照组相比,ARG1,ARG2基因表达分别升高了20倍和1.8倍（p<0.01）,对应的代谢物鸟氨酸含量升高,ODC和SSAT蛋白表达升高,其代谢物腐胺含量升高了103%（p<0.01）,利用ELISA检测精胺含量没有统计学差异。4.添加0.05mmol/L的精氨酸,支持细胞活性显著升高,细胞凋亡率下降了9.7%。5.添加精氨酸后,与热应激相比,精氨酸-NO代谢减弱,表现在i NOS蛋白表达下降了15.3%（p<0.01）,NO含量下降,瓜氨酸不变。精氨酸-精胺代谢增强,表现在ARG1蛋白表达下降了23%（p<0.01）,对应的代谢物鸟氨酸含量不变,ODC蛋白表达升高了41.5%（p<0.01）,SSAT蛋白表达不变,代谢物精胺含量升高了10.2%（p<0.01）。6.外源性添加浓度为5μM的精胺时,NO含量降低了24.3%（p<0.01）,细胞凋亡率下降了44.9%,Caspase3蛋白表达下降了21.7%（p<0.05）,BAX蛋白表达下降了30.9%（p<0.05）,BCL-2蛋白表达升高了16.8%（p<0.05）。根据以上结果,得出以下结论:1.热应激通过激活内源性和外源性途径诱导仔猪睾丸支持细胞发生凋亡,同时降低了细胞中精氨酸水平,增强了精氨酸-NO代谢途径,对精氨酸-精胺代谢途径影响较小,精胺水平基本不变。2.添加外源性精氨酸,支持细胞中精氨酸-NO代谢途径减弱,精氨酸-精胺代谢途径增强,精胺的水平增加。3.添加外源性精胺,细胞中NO水平下降,热应激诱导的内源性途径受到抑制,细胞的凋亡率下降。综上,热应激通过增强精氨酸-NO代谢途径,进而激活内源性和外源性途径诱导支持细胞发生凋亡;添加外源性精氨酸后,精氨酸-精胺代谢增强,外源性精氨酸与精胺均可以降低NO的产生和减弱热应激诱导的支持细胞的凋亡。
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