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目的：miRNA是一类长约22 nt具有调节功能的保守的非编码小RNA，在调控发育时序，细胞增殖与凋亡以及肿瘤发生中起着重要的作用。同时 miRNA也参与了神经细胞的自我更新、脊椎动物的发育、心脏、肌肉以及神经系统的形成等多种生物学过程和信号通路。哺乳动物的雷帕霉素靶(mammalian target of rapamycin, mTOR)是一种非典型丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，具有多种生物学功能，与蛋白质合成、免疫、细胞运动及代谢、细胞凋亡及自噬等均有联系。通过查阅文献我们发现 miRNA-505也许通过影响 ASF/SF2的表达，而参与调控 mTOR通路。为了进一步研究 miRNA-505的生物学功能，我们分别利用质粒 pcDNA6.2、慢病毒载体 FUGW及 Fsy，构建了在哺乳动物细胞中表达 miRNA-505-3p，-5p的载体，它们分别受到病毒来源启动子 CMV（巨细胞病毒）、哺乳动物细胞内源性启动子UBC（泛素酶）及神经元特异性启动子 Syn（突触蛋白I）调控，以获得具有不同表达效率及组织特异性的载体。脂质体法将重组质粒转染至原代培养的神经元细胞与 HEK293T等细胞系中，检测细胞中 miRNA-505的表达量与相关蛋白 ASF/SF2的变化。 方法：将miR-505-3p与miR-505-5p成熟体分别构建成shRNA形式，装入pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR表达载体中，采用PCR方法从pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-505-3p，5p表达载体质粒扩增出miR-505-3p/5p shRNA基因编码区173bp、175bp片段，通过限制性酶切、T4 DNA连接酶连接，分别将miR-505-3p，5p shRNA基因插入慢病毒表达载体 FUGW与 Fsy中，构建成重组载体FUGW-miR-505-3p/5p与Fsy-miR-505-3p/5p。在脂质体介导下将构建成功的慢病毒载体转染至原代培养的神经元细胞和HEK293T等细胞系，荧光显微镜下观测EGFP的表达，流式细胞仪监测转染效率，RT-PCR方法检测细胞中miR-505的表达量。western blot方法检测细胞中相关蛋白ASF/SF2的变化。 结果：1、成功构建带有miRNA-505 shRNA基因片段的四种慢病毒载体FUGW-miR-505-3p，FUGW-miR-505-5p，Fsy-miR-505-3p和Fsy-miR-505-5p。 2、荧光显微镜下观察到，慢病毒载体Fsy-miR-505转染的原代培养的神经元中EGFP荧光强度较高；HEK293T细胞系中，重组质粒总体转染效率较高，FUGW-miR-505转染的细胞EGFP荧光强度最高，Fsy-miR-505转染的细胞EGFP荧光强度最弱。 3、实时荧光定量 PCR结果显示，转染 pcDNA-miR-505-3p、FUGW-miR-505-3p与Fsy-miR-505-3p的细胞中miR-505-3p增多;转染pcDNA-miR-505-5p、FUGW-miR-505-5p与Fsy-miR-505-5p的细胞中miR-505-5p明显增多。 4、Western blot结果显示，共转染miR-505-3p表达质粒和ASF/SF2表达质粒的细胞中ASF/SF2蛋白降低。 结论：结果表明Fsy-miR-505-3p/5p在原代培养的神经元细胞中特异性表达，而在 HEK293T等细胞系中表达比其他两种质粒FUGW-miR-505-3p/5p、pcDNA-miR-505-3p/5p低；Western blot结果表明在Hela细胞中miR-505-3p抑制ASF/SF2蛋白的表达，从而说明ASF/SF2是miR-505-3p的一个靶蛋白。