转座噬菌体是一类特殊的温和噬菌体,其基因组通过转座进行整合和复制。由于其独特的转座特性,转座噬菌体不仅在遗传操作工具开发中有巨大潜力,还可以有效促进基因水平转移并且影响宿主进化。根据基因组结构,转座噬菌体可分为Mu型和B3型,分别以大肠杆菌噬菌体Mu和铜绿假单胞菌噬菌体B3为代表。本论文的研究对象为嗜麦芽寡养单胞菌c31合成的一株温和噬菌体SHP3,根据基因组分析,推测SHP3是一株类似B3的转座噬菌体,其预测的溶原-裂解调控区域与Mu的完全不同。由于B3型转座噬菌体的溶原-裂解调控机制还未见报道,因此本论文在对噬菌体SHP3部分生物学特征进行分析的基础上,开展了对其溶原-裂解调控机制的研究。首先,检测了噬菌体SHP3对温度的敏感性,发现该噬菌体在温度高于55℃时即完全失活;其一步生长曲线显示SHP3侵染敏感菌后,要经历约80 min潜伏期后才进入裂解期;Tail-PCR检测到宿主染色体上SHP3原噬菌体两侧的直接重复序列为5’-CGCAGC-3’;确定了SHP3特有基因orf3的编码产物在体外具有核酸外切酶活性。除了噬菌体生物学特征,系统发育分析也表明SHP3属于B3型转座噬菌体。随后,本论文展开了对噬菌体SHP3溶原-裂解调控机制的研究。生物信息学分析推测orf18至orf21可能编码调控蛋白,且orf19与orf20之间的区域为调控的关键区域。首先在宿主菌中分别过表达orf18至orf21基因,检测菌液上清噬菌体效价,发现过表达orf19的噬菌体效价升高约100倍,而过表达orf20的噬菌体效价则下降约100倍,orf18和orf21基因的表达则不影响噬菌体的效价。同时实验证明orf20的表达能赋予宿主菌对SHP3的超感染免疫能力。据此推测gp19和gp20组成控制噬菌体SHP3溶原-裂解的“开关”,其中gp20是噬菌体SHP3的溶原抑制蛋白,不仅能使噬菌体维持溶原状态,还能够赋予宿主超感染免疫能力。RLM-RACE以及RT-PCR实验发现了启动SHP3基因转录的3个启动子:位于orf19上游的P19、orf20上游的P20、以及orf22上游的P22。利用相互作用检测载体p BCZI,分别检测各个启动子与调控蛋白之间的相互作用。结果显示P19活性受gp19和gp20的抑制,P20活性只受gp20的抑制,P22的活性可被gp1激活。凝胶阻滞实验进一步证明gp19和gp20蛋白均能与相应启动子DNA片段发生结合,说明gp19和gp20是转录调控因子。最后,本论文初步探究了噬菌体SHP3响应MMC诱导的机制。在MMC诱导和非诱导条件下,分别检测了P19和P20的启动子活性,以及gp20的表达量,结果均未发现明显变化,因此目前还无法确定噬菌体SHP3响应MMC诱导的具体机制。综上所述,在实验室前期研究工作的基础上,本论文对噬菌体SHP3的基本生物学特征做了进一步的补充;确定了噬菌体SHP3的溶原-裂解调控“开关”由新的调控蛋白gp19和gp20组成,其基因表达调控模式与Mu噬菌体的完全不同。本论文通过对噬菌体SHP3的基本生物学特征以及溶原-裂解调控机制的研究,增加了对B3型转座噬菌体的认识,为能更好地应用转座噬菌体提供了理论基础。