慢性瘙痒被定义为持续超过6周的瘙痒。据报道,一般人群中慢性瘙痒症的患病率为8.4%至13.9%。引起慢性瘙痒的原因很多,它与皮肤病、传染病、系统性疾病、精神疾病、神经性疾病以及心理疾病有关。与此同时,生活质量和社会心理健康与瘙痒严重程度呈负相关。瘙痒相关的心理症状包括:睡眠质量下降、抑郁、情绪激动、焦虑、饮食习惯改变、自尊心下降和注意力不集中等。随着慢性痒的患病率持续上升,瘙痒的机制研究受到越来越多临床医生的重视。胃泌素释放肽(Gastrin releasing peptide,GRP)是一种被认为与瘙痒感觉有关的神经肽,鞘内注射GRP可以引起小鼠搔抓。GRP由背根神经节(Dorsal root ganglion,DRG)神经元释放。一经释放,GRP激活脊髓背角表达GRP受体(Gastrin releasing peptide receptor,GRPR)的神经元,然后将瘙痒信号传递给更高级的神经元。有研究表明,选择性敲除脊髓神经元上的GRPR,可显著减少瘙痒刺激诱导的抓痒行为。此外,在患有慢性自发性瘙痒症的猕猴中,还发现GRPR及其配体GRP在脊髓和皮肤中高度表达,这是在灵长类动物模型中首次报道此类研究结果。因此,GRPR可以作为衡量痒的重要指标,这为研究电针抑制慢性痒的机制提供了新的理论依据。大麻的镇痛作用为人所知已有几个世纪。然而,由于它们滥用的弊端以及有害的中枢效应,包括耐受性和身体依赖性,限制了它们在临床中的应用。大麻素药物近几年才被批准用于医学应用,主要用于神经性疼痛和多发性硬化症等。最近的实验研究还表明,大麻素可以产生止痒效果。众所周知,上调5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)和去甲肾上腺素可以缓解疼痛。此外,下行抑制通路可以调节大麻素的抗伤害作用。有研究表明,与慢性痛一样,慢性痒的机制也包括痒信号通路的脑干调控机制。5-HT能神经元参与的脑干下行镇痛系统,能够通过激活GRPR神经元上的5-HT1A受体加重瘙痒。有研究表明,电针可以显著激活中脑Ⅰ型大麻素(Cannabinoid receptortype l,CB1)受体,抑制γ-氨基丁酸(Gamma aminobutyric acid,GABA)释放,减弱 GABA 对延髓 5-HT 能神经元的抑制,促进5-HT的释放,从而加强下行抑制系统功能,发挥镇痛作用。那么电针是否通过调控CB1受体的表达和功能,抑制5-HT的释放,从而抑制5-HT1A-GRPR受体偶联的激活,抑制慢性痒中枢环路的敏感化。这为研究电针抑制慢性痒提供了新的思路。综合以上内容,首先我们在本论文的第一部分研究电针是否可以改善慢性痒行为,并筛选出治疗慢性痒的最佳电针频率。其次在本论文的第二部分筛选出治疗慢性痒的最佳电针强度与穴位,综合第一部分结果,筛选出止痒的最佳电针方案。研究最佳方案电针是否通过调控中脑的CB1受体,促进GABA的释放,抑制下行通路中5-HT的释放,从而缓解慢性痒;同时,采用化学遗传学方法,研究激活或抑制外侧中脑导水管周围灰质(lateral periaqueductal gray,1PAG)上的GABA能神经元是否影响慢性痒的形成。最后在本论文的第三部分研究电针是否通过调控外周CB1受体,抑制皮肤以及DRG上GRP的表达,减少皮肤中肥大细胞的聚集以及脱颗粒,从而缓解慢性痒。第一部分电针通过激活κ阿片受体抑制GRPR的表达从而缓解慢性痒目的:(1)研究电针对慢性痒是否具有良性调节作用,制定电针止痒的最佳治疗方案,为临床上电针止痒提供一定的依据。(2)研究强啡肽-A(Dynorphin,DYN-A)与GRPR参与电针止痒的神经生物学机制,为电针止痒提供新的理论依据和治疗策略。方法:(1)慢性瘙痒模型的建立:通过在小鼠颈部施用等体积比(1:1)的丙酮和乙醚混合物(称为AEW处理)诱导慢性瘙痒。(2)采用视频观测系统,检测各组小鼠采用丙酮和乙醚造模前的基础痒行为以及造模后第9天的抓痒次数来评价瘙痒程度。(3)电针组与假电针组:采用韩氏穴位神经刺激仪(LH202,中国)。在采用丙酮和乙醚造模第一天开始在小鼠左侧曲池穴(LI11)和合谷穴(LI4)给予电针治疗,隔天治疗一次,每次治疗30分钟,一共治疗5次。电针强度均为1mA,频率分别为2Hz、15Hz以及100Hz,波宽为0.3ms。假电针组为将毫针浅刺穴位皮下,不通电,留针30分钟即可。(4)在电针治疗开始之前18-20小时腹腔注射选择性κ阿片受体(Kappa opioid receptor,KOR)拮抗剂 Binaltorphimine dihydrochloride(nor-BNI)。(5)采用western blotting方法检测不同频率电针对颈髓中GRPR和DYN-A蛋白表达的影响。(6)采用免疫荧光组织化学方法检测不同频率电针对颈髓背角中GRPR和DYN-A表达的影响。结果:(1)采用丙酮和乙醚造模9天后,与溶媒对照组相比,慢性痒模型组小鼠的痒行为明显增加;在小鼠左侧曲池穴与合谷穴给予强度为1mA,频率分别为2Hz、15Hz和100Hz的电针。隔天电针治疗5次后,与假电针组相比,15Hz或者100Hz电针可以有效缓解慢性瘙痒,100Hz电针止痒效果更好,而低频2Hz电针对慢性瘙痒无显著缓解作用。腹腔注射κ阿片受体拮抗剂nor-BNI,可以显著拮抗100Hz电针缓解慢性痒的作用。(2)采用western blotting方法,结果发现:在慢性痒小鼠颈髓中GRPR的蛋白表达较溶媒对照组显著上调;与慢性痒模型组相比,100Hz电针组颈髓中的GRPR表达显著下调,而2Hz、15Hz电针组以及假电针组中GRPR的表达无显著变化。提示100Hz电针能抑制GRPR的蛋白表达。(3)采用western blotting方法,结果发现:慢性痒小鼠颈髓中DYN-A蛋白表达较溶媒对照组显著下调;与慢性痒模型组相比,100Hz电针组颈髓中的DYN-A表达显著上调,而2Hz、15Hz电针组以及假电针组中DYN-A的表达无显著变化。提示100Hz电针能促进DYN-A的蛋白表达。(4)采用western blotting方法,结果发现:在慢性痒小鼠颈髓中GRPR的蛋白表达较溶媒对照组显著上调;与慢性痒模型组相比,100Hz电针组颈髓中的GRPR表达显著下调;而假电针组中小鼠颈髓中GRPR的表达无显著变化。腹腔注射κ阿片受体拮抗剂nor-BNI,可以显著翻转100Hz电针对于减少小鼠颈髓中GRPR蛋白表达的作用。采用免疫荧光组织化学方法,发现慢性痒小鼠颈髓背角中GRPR免疫反应阳性面积显著高于溶媒对照组;与慢性痒模型组相比,100Hz电针组中颈髓背角的GRPR免疫反应阳性面积显著减少;而假电针组小鼠颈髓背角中GRPR的免疫反应阳性面积无显著变化。腹腔注射κ阿片受体拮抗剂nor-BNI,可以显著翻转100Hz电针减少颈髓中GRPR免疫反应阳性面积的作用。结论:100Hz电针可能是通过促进DYN-A的合成,继而激活κ阿片受体来抑制慢性瘙痒和GRPR表达的最佳频率。第二部分内源性大麻素CB1受体参与电针缓解慢性痒的中枢机制目的:(1)研究电针对小鼠慢性痒行为和痒特异性受体GRPR表达的调控作用,筛选出电针改善慢性痒的最佳治疗方案;(2)研究电针对DYN-KOR-GRPR通路上有关递质和受体表达的影响,以及κ阿片受体在电针止痒和抑制GRPR表达中的关键作用;(3)研究电针对内源性大麻素CB1R-GABA-5-HT-GRPR/DYN通路上有关递质和受体表达的影响;(4)研究中枢内源性大麻素CB1受体在电针激活DYN-KOR-GRPR止痒通路中的关键作用。方法:(1)采用视频观测系统,检测各组小鼠采用丙酮和乙醚造模前的基础痒行为以及造模后第9天的抓痒次数。(2)电针组与假电针组:采用韩氏穴位神经刺激仪(LH202,中国)。在丙酮和乙醚造模当天开始分别在小鼠左侧曲池穴(LI11)与合谷穴(LI4)、血海穴(SP10)与足三里穴(ST36)给予电针刺激,隔天电针1次,每次治疗30分钟,一共治疗5次。电针强度分别为1mA和3mA,频率均为100Hz,波宽均为0.3ms。假电针组为将毫针浅刺曲池穴(LI11)与合谷穴(LI4)穴位皮下,不通电,留针30分钟即可。(3)采用western blotting方法检测电针对颈髓中GRPR和DYN-A蛋白表达的影响以及电针对中脑中CB1受体和CB2受体蛋白表达的影响。(4)采用荧光分光光度法检测电针对延髓组织中5-HT含量的影响。(5)采用免疫荧光组织化学方法检测颈髓背角GRPR和DYN-A的免疫反应性。(6)采用化学遗传学方法,兴奋或者抑制1PAG中的GABA能神经元,检测其对痒行为的影响。结果:(1)采用丙酮和乙醚造模9天后,与溶媒对照组相比,慢性痒模型组小鼠的痒行为明显增加。在小鼠左侧曲池穴、合谷穴或血海穴、足三里穴分别给予强度为1mA和3mA,频率为100Hz,波宽为0.3ms的电针治疗,其中曲池合谷穴1mA电针,曲池合谷穴3mA电针,血海足三里穴1mA电针以及血海足三里穴3mA电针均能显著降低慢性痒模型组小鼠的痒行为,而且曲池合谷穴3mA电针的治疗效果最好。(2)采用丙酮和乙醚造模9天后,western blotting和免疫荧光结果均发现:与溶媒对照组相比,慢性痒模型组小鼠颈髓中GRPR的蛋白表达以及免疫反应阳性面积显著增加;与慢性痒模型组相比,曲池合谷穴1mA电针组,曲池合谷穴3mA电针组,血海足三里穴1mA电针组以及血海足三里穴3mA电针组小鼠颈髓中的GRPR的蛋白表达以及免疫反应阳性面积均显著降低,而且曲池合谷穴3mA电针组中颈髓中的GRPR的蛋白表达以及免疫反应阳性面积减少得最为明显。(3)采用丙酮和乙醚造模9天后,western blotting结果发现:与溶媒对照组相比,慢性痒模型组小鼠颈髓中DYN-A的蛋白表达显著减少;与慢性痒模型组相比,曲池合谷穴1mA电针组,曲池合谷穴3mA电针组,血海足三里穴1mA电针组以及血海足三里穴3mA电针组的小鼠颈髓中的DYN-A的蛋白表达均显著增加,而且曲池合谷穴3mA电针组的小鼠颈髓中的DYN-A的蛋白表达增加得最为明显。免疫荧光结果发现:与溶媒对照组相比,慢性痒模型组小鼠颈髓中DYN-A的免疫反应阳性面积显著减少;血海足三里穴1mA电针组以及血海足三里穴3mA电针组与慢性痒模型组相比没有显著性差异,而曲池合谷穴1mA电针组和曲池合谷穴3mA电针组颈髓中DYN-A的免疫反应阳性面积显著减少,提示曲池合谷穴1mA电针和曲池合谷穴3mA电针均能促进颈髓背角中DYN-A的释放,而且曲池合谷穴3mA电针促进颈髓背角中DYN-A释放的作用更为明显。(4)采用丙酮和乙醚造模9天后,慢性痒模型组小鼠的痒行为明显增加。在小鼠左侧曲池穴与合谷穴给予强度为3mA,频率为100Hz,波宽为0.3ms的电针,减少了慢性痒小鼠的抓痒次数,而假电针对小鼠的慢性痒行为无明显抑制作用。(5)采用丙酮和乙醚造模9天后,与溶媒对照组相比,慢性痒模型组小鼠中脑组织中的CB1受体蛋白表达显著升高;与慢性痒模型组相比,曲池合谷穴3mA电针组的小鼠中脑CB1受体的蛋白表达显著降低;而假电针组小鼠中脑CB1受体的蛋白表达无明显变化。此外在各组小鼠中脑组织中CB2受体的蛋白表达无显著性差异。(6)采用丙酮和乙醚造模9天后,与溶媒对照组相比,慢性痒模型组小鼠延髓组织中的5-HT含量显著下降,提示5-HT释放增加;与慢性痒模型组相比,曲池合谷穴3mA电针组小鼠延髓组织中的5-HT的含量显著升高,而假电针组小鼠延髓组织中的5-HT的含量无显著变化,提示电针抑制慢性痒小鼠延髓组织中的5-HT释放。(7)采用丙酮和乙醚造模,隔天电针,电针前10分钟腹腔注射CB1受体拮抗剂AM251,造模后第9天的行为学结果发现:与溶媒对照组的相比,慢性痒模型组的抓痒次数显著升高;与慢性痒模型组相比,慢性痒+AM251组的抓痒次数没有明显变化,而电针组以及电针+AM251组的抓痒行为显著减少;电针+AM251组小鼠的抓痒次数显著高于电针组。(8)采用丙酮和乙醚造模9天后,与溶媒对照组相比,慢性痒模型组小鼠延髓组织中的5-HT含量显著下降,提示5-HT释放增加;与慢性痒模型组相比,曲池合谷穴3mA电针组小鼠延髓组织中5-HT的含量显著升高,提示电针抑制慢性痒小鼠5-HT释放;腹腔注射CB1受体拮抗剂AM251可以显著翻转电针升高延髓组织中5-HT含量的作用,提示CB1受体可能参与电针抑制5-HT释放的作用。(9)在1PAG以 1:3 的体积比注射rAAV-mDIx-Cre-WPRE-pA和rAAV-Ef1α-DIO-mCherry-WPRE-pA空载病毒。21天后,采用丙酮和乙醚造模。9天后,在检测行为学前1小时,腹腔注射氯氮平-N-氧化物(Clozapine N-oxide,CNO),此时并未激活1PAG上的GABA能神经元。结果发现:采用丙酮和乙醚造模,与溶媒对照组(mCherry)相比,慢性痒模型组(mCherry)的抓痒次数显著升高;与注射了mCherry空载病毒的慢性痒模型组小鼠相比,注射了hM3D(Gq)病毒的慢性痒模型组小鼠的痒行为显著降低;而与注射了hM3D(Gq)病毒的溶媒对照组小鼠相比,注射了 hM3D(Gq)病毒的慢性痒模型组小鼠的抓痒次数无明显升高;该结果提示兴奋1PAG上的GABA能神经元可以模拟电针缓解慢性痒的作用。(10)在1PAG以 1:3的体积比注射rAAV-mDIx-Cre-WPRE-pA和rAAV-Ef1α-DIO-hM4D(Gi)-mCherry-WPREs-pA病毒。21天后,采用丙酮和乙醚造模,9天后,在检测行为学前1小时,腹腔注射CNO,抑制了1PAG上的GABA能神经元。结果发现:与溶媒对照组相比,慢性痒模型组小鼠的抓痒次数显著升高;与慢性痒模型组相比,电针组和假电针组小鼠的抓痒次数没有明显差异。该结果提示抑制1PAG上的GAB A能神经元拮抗了电针止痒的作用。结论:电针通过下调中脑CB1受体的表达,减弱其对GABA能神经元的抑制作用,减少5-HT的释放,从而改善慢性痒。1PAG上的GABA能神经元参与了电针对于慢性痒的调控。第三部分内源性大麻素CB1受体参与电针缓解慢性痒的外周机制目的:研究内源性大麻素CB1受体介导电针抑制外周GRP表达以及肥大细胞数目增多的机制。方法:(1)电针组与假电针组:采用韩氏穴位神经刺激仪(LH202,中国)。在使用丙酮和乙醚造模当天开始分别在小鼠左侧曲池穴(LI11)与合谷穴(LI4)给予电针刺激,隔天电针1次,每次治疗30分钟,一共治疗5次。电针强度为3mA,频率为100Hz,波宽为0.3ms。假电针组为将毫针浅刺曲池穴(LI11)与合谷穴(LI4)穴位皮下,不通电,留针30分钟即可。(2)采用甲苯胺蓝染色的方法,检测小鼠颈部皮肤中肥大细胞的数目。(3)采用免疫荧光组织化学方法检测小鼠颈部皮肤以及DRG组织中CB1受体以及GRP的表达。(4)采用western blotting方法检测电针对小鼠颈部皮肤中CB1受体蛋白表达的影响。结果:(1)采用丙酮和乙醚造模9天后,与溶媒对照组相比,慢性痒模型组小鼠颈部皮肤组织中肥大细胞数目显著增多;与慢性痒模型组相比,电针组中小鼠颈部皮肤组织中肥大细胞的数目显著减少;而假电针组小鼠颈部皮肤组织中肥大细胞的数目无显著变化。(2)采用丙酮和乙醚造模9天后,免疫荧光结果发现:与溶媒对照组相比,慢性痒模型组小鼠颈部真皮内以及DRG中GRP的免疫反应阳性面积显著增加;与慢性痒模型组相比,电针组小鼠颈部真皮内以及DRG中GRP的免疫反应阳性面积显著降低;而假电针组小鼠颈部真皮内以及DRG中GRP的免疫反应阳性面积无明显变化。(3)采用丙酮和乙醚造模9天后,western blotting和免疫荧光结果均发现:与溶媒对照组相比,慢性痒模型组小鼠颈部皮肤以及DRG中CB1受体的蛋白表达以及免疫反应阳性面积显著增加;与慢性痒模型组相比,电针组小鼠颈部皮肤以及DRG中CB1受体的蛋白表达和免疫反应阳性面积均显著降低;而假电针组小鼠颈部皮肤以及DRG中CB1受体的蛋白表达以及免疫反应阳性面积无明显变化。(4)采用丙酮和乙醚造模9天后,与溶媒对照组相比,慢性痒模型组小鼠皮肤组织中的肥大细胞数目显著增加,同时小鼠颈部真皮组织以及DRG中GRP的免疫反应阳性面积显著升高;与慢性痒模型组相比,电针组小鼠颈部皮肤组织中的肥大细胞数目显著减少,小鼠颈部皮肤真皮以及DRG组织中GRP的免疫反应阳性面积显著减少;腹腔注射CB1受体拮抗剂AM251可以显著翻转电针的作用。结论:电针通过下调颈部皮肤以及DRG中CB1受体的表达,减少颈部皮肤中肥大细胞的数目,减少颈部皮肤真皮内以及DRG中的GRP的表达,从而改善慢性痒。