Syncytin-1在子宫内膜异位症中的表达及其表观遗传学调控

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目的:确定syncytin-1在子宫内膜异位症及子宫内膜异位症患者子宫内膜中的表达,探讨syncytin-1在子宫内膜异位症中的意义。通过检测基因组总体甲基化的水平,明确总体甲基化和syncytin-1表达水平之间的关系,探讨总体甲基化对于syncytin-1表达调控的影响。启动子区CpG岛甲基化程度和syncytin-1表达之间的关系,明确其对于syncytin-1表达调控的作用。探讨甲基转移酶3b亚型和syncytin-1表达之间的关系,明确甲基转移酶3b亚型和syncytin-1启动子区CpG岛甲基化之间的相关性,探讨甲基转移酶3b亚型在syncytin-1表达调控过程中的作用。材料和方法:从组织中提取RNA,通过反转录获得cDNA,然后应用实时定量PCR和免疫组化的方法,分别检测syncytin-1在子宫内膜异位症及子宫内膜异位症患者子宫内膜中的mRNA水平和蛋白水平,子宫内膜异位症患者的子宫内膜为对照组。选择LINE-1作为代表总体甲基化的基因,以重亚硫酸氢盐转化后的基因组DNA为模板,用LINE-1的引物做PCR,然后用联合亚硫酸氢盐限制分析(combined bisulfite restriction analysis, COBRA)的方法检测LINE-1的甲基化水平。为了在蛋白水平检测总体甲基化的程度,做5-mC的免疫组化染色。以重亚硫酸氢盐转化过的基因组DNA为模板,行syncytin-1启动子区的巢式PCR,通过琼脂糖凝胶电泳将PCR产物分离纯化出syncytin-1的DNA,然后将纯化DNA连入空质粒,转染到感受态细胞,在LB培养基中37℃孵育14小时,提取质粒DNA,并做syncytin-1启动子区的DNA测序,对比两组CpG岛的甲基化程度和位点。为了进一步探讨启动子区CpG岛的甲基化和syncytin-1表达之间的关系,再用Cobra的方法检测两组CpG岛的甲基化比例。从组织中提取RNA,通过反转录获得cDNA,然后以cDNA为模板,行甲基转移酶3b亚型的实时-定量PCR。结果:子宫内膜异位症中的mRNA表达水平,是对照组mRNA水平的1.9倍,免疫组化染色显示,子宫内膜异位症中syncytin-1的蛋白表达水平,亦高于对照组的蛋白水平。Cobra的结果显示,在子宫内膜异位症和对照组,LINE-1的甲基化比例分别为75%和74%,两组之间没有明显差异,而免疫组化也表明,5-mC的染色在两组之间没有明显差异。测序的结果显示,子宫内膜异位症和对照组syncytin-1启动子区CpG岛甲基化的比例分别为84%,95%,两组之间存在统计学差异。结果还显示,去甲基化主要发生在5’端的第二个CpG位点。Cobra的结果也表明,子宫内膜异位症和对照组syncytin-1启动子区CpG岛甲基化的比例分别为51%和65%,两组之间也存在统计学差异。结果显示,与对照组相比,子宫内膜异位症的甲基转移酶3b3的mRNA水平下降约40%,而子宫内膜异位症中甲基转移酶3b7的mRNA水平则是对照组的近2倍,甲基转移酶3b6的表达太低,无法检测,两组间其他亚型没有明显差异。结论:syncytin-1在子宫内膜异位症和对照组中均有表达,其在子宫内膜异位症中的表达水平,高于对照组。在子宫内膜异位症和对照组,总体甲基化的水平没有明显差异,说明总体甲基化和syncytin-1的表达之间没有内在联系,整体甲基化不参与syncytin-1的表达调控。syncytin-1启动子区CpG岛的去甲基化能增加syncytin-1的mRNA和蛋白水平,并以此方式参与syncytin-1的表达调控。甲基转移酶3b3的低表达和甲基转移酶3b7的高表达可能协同发挥作用,共同参与syncytin-1的表达调控。
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