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目的:构建高效表达iNOS基因的3T3细胞,在隔离培养条件下,观察NO能否提高环磷酰胺(CAP)和钴60射线对L1210细胞的损伤效应,探讨NO的作用机制,期待为临床白血病的治疗提供新的思路。材料和方法:1 实验材料:L1210细胞、3T3细胞、大肠杆菌DH5α、pcDNA3.0-iNOS质粒、pcDNA3.0质粒及自制隔离培养器。2 实验方法:⑴ 质粒的转化、抽提、酶切鉴定和转染按照分子克隆常规操作,转染细胞鉴定按试剂操作说明书进行RT-PCR、免疫组化和NO含量检测。⑵ NO对L1210细胞作用培养分组:将L1210细胞加入隔离培养器内培养,12孔板内分别接种质粒和空载体转染的3T3细胞,隔离培养器内外细胞培养液均为0.75ml。根据实验设计分为NO对L1210的作用及机制研究、NO提高钴60射线对L1210细胞损伤效应及其机制研究和NO提高CAP对L1210细胞损伤效应及其机制研究三部分,每部分根据12孔板内接种的转染细胞不同分为三组,①pcDNA3.0-iNOS转染3T3细胞组,②pcDNA3.0转染3T3细胞组。③pcDNA3.0-iNOS转染3T3细胞加上终浓度为100μmmol/L的DEVD-CHO(Caspase-3特异性抑制剂)组。⑶ NO提高CAP和钴60射线对L1210细胞损伤效应的检测方法:收集各组L1210细胞12、24、48、72 h的标本,台盼蓝染色观察直接损伤的作用,TUNNEL法观察诱导细胞凋亡的情况,收集各组L1210细胞4、8、12、24、48、72 h的标本流式细胞检测细胞周期观察细胞的增殖状态。结果:1 转染细胞的鉴定:⑴ 质粒鉴定:质粒双酶切后电泳出现两条DNA带,第一条与空载体pcDNA3.0的DNA带相齐,第二条与人iNOScDNA片段大小一致。质粒分别以T7和BGH作正反两个方向测序,测序结果与Genebank上iNOS序列吻合。⑵ RT-PCR鉴定转染细胞:RT-PCR扩增产物电泳显示,PCR反应时质粒转染组扩增出约600 bp的DNA带,与根据人iNOS基因设计引物的目的片段大小一致,而对照组和空载体转染组未扩增出相应的DNA带。⑶ 免疫组化结果:对照组和空载体转染组未有荧光出现,质粒pcDNA3.0-iNOS转染组在3T3细胞内有黄绿色的iNOS蛋白。⑷ 培养上清NO含量:比空载体转染组和对照组NO的含量比较显示质粒转染组在各时相点均显著增高(P<0.01),载体转染组和对照组NO的含量在各个时相点无显<WP=9>著差异(P>0.05)。2 NO对L1210细胞的作用及其机制研究:⑴ NO对L1210细胞的直接损伤作用:24 h开始质粒转染组L1210细胞台盼蓝拒染率比空载体转染组显著下降(P<0.05)。DEVD-CHO在48 h有显著的逆转作用(P<0.05)。⑵ 细胞凋亡检查结果:质粒转染组较空载体转染组L1210细胞凋亡率12 h有显著的增加(P<0.05),24 h开始细胞凋亡率有非常显著性的差别(P<0.01)。加DEVD-CHO后,细胞凋亡率下降,24 h开始与质粒转染组有显著的差异(P<0.05)。3 NO提高钴60射线对L1210细胞损伤效应及其机制研究:⑴ NO对12 Gy钴60照射后L1210细胞直接损伤作用的影响:各组L1210细胞台盼蓝拒染率随时间的延长而减低,质粒转染组L1210细胞下降更快,与空载体组相比12 h开始有显著差异(P<0.05),72 h有非常显著性差异(P<0.01)。质粒转染组加DEVD-CHO后能够提高台盼蓝拒染率,24 h开始有显著的差异(P<0.05)。⑵ NO对12 Gy钴60照射后诱导L1210细胞凋亡的影响:射线照射后L1210细胞凋亡率持续上升,质粒转染组24 h开始细胞凋亡率明显升高,与空载体转染组细胞凋亡率相比有显著差异(P<0.05),质粒转染组加DEVD-CHO后细胞凋亡率有所下降,24 h开始与单独质粒转染组有显著的差异(P<0.05)。⑶ NO对12 Gy钴60照射后L1210细胞周期的影响:射线照射后质粒转染组L1210细胞G1期上升很快,4 h与空载体组相差显著(P<0.05),8、12 h升至高峰,两组无明显差异(P>0.05),24 h后空载体转染组G1期下降较快,质粒转染组G1期保持较高水平(P<0.05)。质粒转染组加DEVD-CHO后G1期上升较单纯质粒转染组慢,4 h两组相差显著(P<0.01),8、12 h两组无明显差异(P>0.05),24 h后下降,与单纯质粒转染组相差显著(P<0.05)。钴60射线照射后S期4 h下降,其中质粒转染组下降更快。质粒转染组加DEVD-CHO在4 h与质粒转染组相差显著(P<0.05),空载体转染组和质粒转染加DEVD-CHO与单纯的质粒转染组S期8、12 h无显著差别(P>0.05),24 h后两组都开始回升,质粒转染组持续较低(P<0.05)。4 NO提高CAP对L1210细胞损伤效应及其机制研究:⑴ NO对CAP作用下L1210细胞直接损伤作用的影响:质粒转染组L1210细胞较空载体组台盼蓝拒染率下降更快,12 h开始两组有显著差异(P<0.05)。DEVD-CHO在24 h后能够提高台盼蓝拒染率(P<0.05)。⑵ NO对CAP作用下诱导L1210细胞凋亡的影响:质粒转染组的L1210细胞凋亡率升高更快,与空载体转染组各时相点有显著差异(P<0.05)。DEVD-CHO能够使细胞凋亡率下降(P<0.05)。⑶ NO对CAP作用下L1210细胞周期的影响:CAP作用4 h后各组L1210细胞周期G1期显著升高,S期迅速下降,质粒转染组比空载体转染组G1期升高快,S期4h下降快(P<0.05),8、12 h细胞G1期和S期两组无明显差异(P>0.05),24 h空载体转染组G1期下降和S期上升较快(P<0.05)。加入DEVD-CHO 4 h后G1期<WP=10>上升较单纯质粒转染组慢(P<0.05),8、12 h两组无明显差异(P>0.05),24 h后G1期下降快(P<0.05),4 h细胞S期下降较质粒转染组慢(P<0.05),8、12 h无显著差别(P>0.05),24 h后两组都开始回升,单纯