近年来,乳腺癌组织局部脂质代谢状况在肿瘤发生发展中的作用越来越为人们所关注。团队前期研究发现在膳食活性物质染料木素促进乳腺癌细胞增殖过程中,伴随着甘油激酶（Glycerol kinase,GK）表达水平的升高;转录组分析提示GK的表达与细胞增殖调控密切相关。GK是介导细胞利用游离甘油的限速酶,在正常乳腺组织中表达水平比较低。我们推测GK的异常表达可能促进乳腺癌细胞对周围甘油等能源物质的摄取与利用,进而促进肿瘤细胞迅速增殖。目标:本课题研究旨在结合生物信息学分析以及多种乳腺癌细胞实验,观察GK表达水平以及活性水平的变化对乳腺癌细胞增殖状态的影响,并在此基础上进一步探索脂滴贮存与内质网应激在GK促进肿瘤细胞增殖具体机制当中的作用,为筛选治疗乳腺癌的代谢靶点提供前期基础。研究方法:1.利用公共数据库GEPIA以及TIMER,观察GK在乳腺癌组织与正常乳腺组织的表达状况;利用UALCAN数据库分析分子分型、肿瘤TNM分期以及肿瘤组织学类型等因素对瘤体组织样本中GK表达水平的影响;利用Kaplan-Meier Plotter数据库分析乳腺癌组织内GK表达水平与患者的预后之间的关联,综合评价乳腺癌细胞GK表达状况相关研究的临床应用价值。2.以乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7细胞为基础,借助慢病毒感染方法,建立GK过表达细胞模型,结合GK特异性抑制剂（1-thiolglycerol）观察GK活性变化对乳腺癌增殖能力的影响。检测各处理组细胞甘油利用状况确定实验干预效果后,依托MTT方法绘制各处理组细胞的增殖曲线结合EDU染色实验以及Western-Blot检测增殖经典靶点PCNA蛋白水平,综合评价并比较各处理组细胞增殖状态。此外,通过检测甘油利用能力、尼罗红染色实验观察细胞脂滴贮存状态以及Western-Blot检测内质网应激经典靶点（p-PERK、GRP78、XBP1s、ATF4）的蛋白水平,以观察在GK促进乳腺癌细胞增殖的同时,是否伴随脂滴贮存等甘油脂类代谢变化以及内质网稳态维持状态的差异。3.为探究内质网稳态维持状态对GK促进细胞增殖效应的影响,我们利用内质网应激抑制剂（4-PBA）缓解GK过表达所引发的细胞内质网应激。Western-Blot法检测内质网应激经典靶点的蛋白水平确定干预效果后,比较各处理组细胞增殖能力的差异;同时通过尼罗红染色观察细胞脂滴贮存状态,以探索内质网稳态维持与肿瘤细胞内脂滴贮存之间的内在联系。4.为探究脂滴贮存状态对GK引发内质网应激促进细胞增殖效应的影响,我们利用脂滴贮存抑制剂（PF-06424439）,人为阻断GK过表达促进细胞内脂滴贮存加强的效应。尼罗红染色验证细胞内脂滴贮存状态的干预效果后,比较各处理组细胞增殖能力的差异;同时,利用Western-Blot法检测内质网应激经典靶点的蛋白水平,以探索肿瘤细胞内脂滴贮存与内质网稳态维持之间的内在联系。此外,还通过检测细胞内总钙离子浓度以及内质网特异性钙离子荧光染色定量,探究脂滴贮存状态对内质网内钙稳态的潜在影响,初步探索脂类代谢引发内质网应激的可能机制。主要结果:1.通过GEPIA数据库分析发现GK在乳腺癌中的表达高于卵巢浆液性囊腺癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、子宫癌肉瘤等其他恶性肿瘤组织;TIMER数据库显示:GK在乳腺癌组织中表达异常,显著高于正常组织。UALCAN数据库分析结果表明:GK在Luminal、HER 2 positive和Triple negative三种类型乳腺癌组织中均呈现出显著过表达,其表达水平明显高于正常乳腺组织;且在较低肿瘤TNM分期的乳腺癌组织当中,GK的表达水平相对更高,尤其是在TNM 1期。利用Kaplan-Meier Plotter数据库资源,我们分析进一步发现:GK高表达的乳腺癌患者的五年生存率（HR=1.34,95%CI:1.06～1.71,P=0.016）更低,与GK低表达组相比较具有统计学显著性差异,表明GK过表达的患者预后效果较差。2.在乳腺癌MDA-MB-231以及MCF-7细胞中,我们均发现GK过表达组细胞利用游离甘油的能力显著加强,而GK抑制剂的作用使得细胞对甘油的利用能力减弱;增殖曲线、EDU染色实验以及细胞增殖经典靶点PCNA的Western-Blot蛋白水平检测结果一致表明:GK的活性高低与细胞的增殖能力成正相关,GK过表达组细胞增殖能力显著强于空载病毒感染对照细胞组,且GK抑制剂可完全阻遏GK过表达引发的促细胞增殖效应。甘油利用能力检测结果发现GK过表达加强甘油利用能力,而加入GK特异性抑制剂后,甘油利用能力受到抑制。尼罗红染色结果发现胞内脂滴贮存状态与GK活性状态以及细胞增殖水平均呈现也正相关关系。内质网应激经典靶点蛋白水平Western-Blot检测提示:伴随细胞增殖能力加强,肿瘤细胞出现了内质网稳态的破坏。3.应用内质网应激抑制剂4-PBA可显著缓解内质网应激状态,内质网应激经典靶点蛋白水平显著下降。在此过程中,GK促进细胞增殖的效应也被阻遏。尼罗红染色结果显示:内质网应激状态的改变对细胞内脂滴的贮存没有显著影响。4.脂滴贮存抑制剂PF-06424439的处理可阻断GK过表达引发的肿瘤细胞内脂滴贮存加强。同时,GK促进细胞增殖的效应被逆转,伴随着内质网应激经典靶点蛋白水平的下调,提示甘油脂类代谢与内质网稳态维持之间存在内在联系。为进一步探索甘油脂类代谢影响内质网稳态的可能机制,我们通过检测细胞内总钙离子浓度以及内质网内钙离子分布评价在不同处理过程中乳腺癌细胞内质网钙稳态的状况。实验结果表明:GK活性变化以及脂滴贮存的人为干预均可显著影响内质网钙贮存状态,而内质网应激的抑制剂对内质网钙离子浓度没有显著影响。提示:GK异常表达可能是介由加强胞内脂滴贮存,引发内质网钙稳态失衡,进而诱导内质网应激。结论:GK在各分型乳腺癌中广泛高表达,显著高于相应正常组织表达水平且与乳腺癌患者五年短期生存率密切相关,提示其可能与乳腺癌的发生发展存在关联。本课题通过一系列细胞-分子生物学实验在多种乳腺癌细胞内证实GK活性上调可显著促进肿瘤细胞的增殖,且在此过程中伴随着胞内脂滴贮存加强以及内质网应激的发生。在进一步的机制探索中,我们发现GK有可能是通过加强肿瘤细胞对游离甘油的利用,促进胞内脂滴的贮存,引发内质网应激,最终诱导细胞增殖。此外,我们还发现甘油脂类代谢对内质网稳态维持的影响,可能与其促发内质网钙稳态失衡有关。