研究课题来源本课题来源于国家973重点基础研究发展计划(2010CB945502)。研究背景和目的、意义诱导型多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells, IPS cells)是指将体细胞重编程为具有多分化潜能的干细胞。这些干细胞在形态学、表观遗传学、全基因表达谱以及特异的细胞类型分化潜能方面与ES细胞极为相似,而且解决了ES细胞在临床应用方面存在的免疫排斥、来源有限及伦理问题,目前已通过实验证明,将一定数量级的ips细胞移植到小鼠的生殖系统内可发育为一个完整的个体,因此ips细胞是细胞治疗以及组织器官再生领域最有前景的种子细胞之一iPS细胞最先由Takahashi和Yamanaka在2006年通过利用逆转录病毒载体在小鼠成纤维细胞中导入了与多功能性有关的基因(Oct4、Sox2、 c-Myc和Klf4),利用多能性标志分子Fbx15的表达对其转染后的细胞进行筛选,最终得到了具有胚胎干细胞某些特性的多功能干细胞,并命名为“诱导产生的多能性干细胞”。2007年7月,Yamanaka研究小组进一步利用Nanog代替Fbx15进行筛选,得到了Nanog+的iPS细胞系,这样取得的iPS细胞更接近于胚胎干细胞。2008年以后,iPS技术发展非常迅速,科学家进一步改进和完善了该技术。鉴于c-Myc为原癌基因,导入c-Myc会使肿瘤发生率明显增高,可能会阻碍其未来的临床应用,为了避免逆转录病毒载体导致的致癌风险,山中伸弥实验室和哈佛大学康拉德·霍克林格的实验室于2009年成功地制备了非病毒整合鼠的ips细胞。此外,美国哈弗大学研究人员采取添加特殊化合物(如巴尔普罗酸)的方法,将体细胞重编程为iPS细胞的效率提高了100多倍。这些结果均提示了通过纯化学物质进行重组的可能性,这也为我们将来应用ips细胞进行细胞治疗提供了更安全、更具实用价值的技术平台。iPS细胞技术的问世,使得一些遗传性疾病或退行性疾病发展的病理学过程可在培养皿中进行准确观察。近期,Park等利用iPS技术成功建立了10种人类遗传性或退行性疾病起源的干细胞系,其中包括腺苷脱氨酶缺乏相关的重症联合免疫缺陷病(ADA-SCI D)、亨廷顿病(HD)、帕金森病(PD)与青少年发生Ⅰ型糖尿病(JDM)等。与此同时,国内外有大量的实验及研究是关于ips细胞可在体外定向分化为某些具有特定功能的细胞,这些分化后的细胞可用于视网膜病变、耳蜗神经方面、心血管疾病、脑神经方面及糖尿病治疗的研究。然而,目前关于ips细胞在受损的活体肝脏内是否可参与肝脏的再生修复以及如何参与再生的研究及报道甚少。国内曾有学者通过在体外模拟体内的生理条件,特异性的诱导ips细胞,成功地使得ips细胞遵循正常的发育路线定向分化为有功能的肝细胞,然而,该实验并非真的在体内进行,其次是成本极高,诱导产生的细胞数量少,因此仍然难以证明ips细胞在体内亦能定向分化为有功能的肝细胞,关于这一问题,国外的学者则通过体内实验,把ips细胞注入延胡索酰乙酰乙酸酶缺陷(fumaroylacetoacetate hydrolase, FAH)孕小鼠的胚胎,FAH小鼠因缺乏该酶可致酪氨酸血症表现为进行性肝功能衰竭及肾小管坏死而很快死亡,实验发现胚胎期注射了ips细胞来源的肝细胞的FAH小鼠出生后血清肝功能指标及肝脏组织病理切片均正常,而未注射组的FAH小鼠出生后6周则出现肝功能衰竭,肝组织结构紊乱,肝细胞大量坏死,该实验成功地证明了ips细胞来源的肝细胞在体内可定向分化为有功能的肝细胞,但是该实验移植所用的肝细胞是来源于完全由ips细胞发育成一个完整个体后的肝组织,因此,移植所用的细胞为成熟的有功能的肝细胞,该细胞为ips细胞在参与个体发育过程中分化产生的,并非直接研究ips细胞或者ips细胞来源的拟胚体(embryoid bodies, EBs)在受损的肝脏中是否可直接诱导为有功能的肝细胞,此外,该实验的成本较前者实验更高。因此,本实验尝试通过联合运用D-氨基半乳糖(D-GaIN)、脂多糖(LPS)与肝脏部分切除术,建立较单纯化学性肝损伤或单纯的肝部分切除术损伤程度更为严重、损伤范围更为广泛的小鼠急性肝损伤模型,将ips细胞来源的拟胚体(embryoid bodies, EBs)移植到该小鼠模型,通过观察移植组与对照组小鼠血清肝功能指标(谷丙转氨酶、谷草转氨酶及血清白蛋白)、ips细胞在体内分布的指标(绿色荧光蛋白,GFP)、ips细胞在体内分化为功能性肝细胞的指标(白蛋白与角蛋白18)等,探讨ips细胞来源的EBs在该动物模型中是否可被定向诱导分化为有功能的肝细胞,从而参与肝损伤后的肝脏再生。研究方法及内容一、实验分组及小鼠化学性肝损伤模型建立将小鼠按随机化原则均分为D-GaIN/LPS/肝脏部分切除组与肝脏部分切除组。D-G aIN/LPS/肝脏部分切除组：腹腔注射D-GaIN和LPS溶液,分别按500mg/kg,50μg/kg,先注射D-GaIN溶液,1h后注射LPS溶液；肝脏部分切除组：生理盐水分别代替D-GaIN与LPS,注射方法同上。二、小鼠肝脏的1/3切除第2次腹腔注射24h后,所有小鼠行肝脏1/3切除术。乙醚吸入麻醉,剑突下0.5-1.0cm竖直切口,钝性分离,用手术线从根部结扎左外叶并将其切除,将结扎端埋入腹腔,逐层缝合切口。三、肝脏体质量比值、肝再生百分率计算小鼠的五叶肝脏中,左外叶占其肝脏总重35%-41%,因此,切除左外叶即可达到理论上的1/3肝切除。四、肝细胞形态学及ips细胞在肝脏分布的观察小鼠肝脏1/3切除术后第3、7和14天处死小鼠并取出肝脏称重,常规固定,石蜡包埋及切片。采用苏木精-伊红染色观察肝细胞形态。移植后40d取移植组小鼠新鲜肝脏行冰冻切片,观察ips细胞在体内的分布情况。五、BrdU注射及BrdU、CK19、c-kit免疫组织化学检测BrdU注射：腹腔注射,按75mg/kg,共2次,每次间隔8h,最后1次注射24h后处死动物并取肝脏。免疫组织化学染色按说明书操作,苏木精复染(BrdU染色后经苏木精-伊红复染),显微镜下观察。应用Image-Pro plus6.0专业图像分析软件对染色阳性部位灰度值进行定量分析。研究结果1、两组小鼠肝脏大体观察及称重结果,提示肝脏部分切除组术后第9天肝大体结构基本恢复正常,肝质量已接近术前值,第14天颜色、质地已基本恢复正常,之后按正常生长规律增加,残余肝脏代偿增大,结扎部位增生组织颜色呈较淡黄色,未见新肝叶；而D-GaIN/LPS/肝脏部分切除组第14天肝质量较术前仍偏小。2、两组小鼠肝部分切除后24h肝脏石蜡切片伊红-苏木精染色结果提示,D-GaIN/LPS/肝脏部分切除组术后肝窦和中央静脉充血,库普弗细胞(Kupffer’s cell)增多；肝脏部分切除组小鼠肝脏仅有轻度的病理损伤。3、两组小鼠在肝部分切除后各个时间点肝脏石蜡切片BrdU、C-kit与CK19染色结果提示,肝脏部分切除术后第7天,肝脏部分切除组小鼠肝内可见大量散在分布BrdU阳性细胞,而D-GaIN/LPS/肝脏部分切除组BrdU阳性细胞甚少。D-GaIN/LPS/肝脏部分切除组小鼠肝脏于术后第3天开始出现C-kit与CK18阳性的肝卵圆干细胞增生,从汇管区开始向肝小叶内延伸以修复损伤,而肝部分切除组小鼠肝内至第14天仍未见明显C-kit与CK18阳性的细胞。4、D-GaIN/LPS/肝脏部分切除组小鼠在EBs肝脏定向移植后40天ALT、AST、ALB等肝功能指标恢复正常,小鼠肝内可见局灶状分布的GFP阳性细胞,经肝脏冰冻切片免疫荧光双染色可发现GFP和CK18双阳性细胞。结论1、成功建立了小鼠D-氨基半乳糖/L脂多糖／肝脏部分切除动物模型；2、D-氨基半乳糖与脂多糖对部分肝切除术后成熟肝细胞的再生具有显著的抑制作用；3、小鼠D-氨基半乳糖／脂多糖／肝脏部分切除动物模型使得肝切后残余的成熟肝细胞由于事先受到化学损伤而无法通过正常途径再生,转而刺激肝脏内源以及外源的干细胞增殖、分化为成熟的肝细胞,进而修复受损伤的肝脏；4、EBs在体内定向分化为肝细胞的同时,个别小鼠在移植部分出现畸胎瘤,因此,该拟胚体的安全性仍有待提高。