[研究背景和目的]:脓毒症是危重症的主要原因之一,发病机制十分复杂,尚无特效的方法。病情迁延可引起多器官功能障碍综合征(Multiple organ dysfunction syndrome,MODS)和微循环和线粒体窘迫综合征(Microcirculatory and mitochondrial distresssyndrome,MMDS),甚至死亡。线粒体是细胞活动的主要供能场所,是机体物质代谢和能量转化的中心,三羧酸循环、呼吸链电子传递及氧化磷酸化均在此进行。它除了产生ATP供给细胞所需能量外,对细胞氧化还原状态和渗透压调节、钙稳态、PH维持及细胞凋亡信号传导起重要作用。线粒体结构和功能对细胞、组织乃至整个机体功能起着关键性作用,其损伤和衰竭与脏器功能损伤及脓毒症的预后密切相关。脓毒症早期即可发生线粒体损伤,损伤机制尚不明确。近年研究证实,MMDS是脓毒症的主要死亡原因之一,早期诊断、干预可防止MMDS的发生能够降低脓毒症的死亡率。本研究制作LPS致大鼠脓毒症的模型,有针对性地选取肾脏、肾上腺、脑、肝脏等组织脏器,对早期脓毒症过程中线粒体的损伤及其机制及进行相关研究,并初步探索其早期干预方法。[研究方法]:(一)动物模型:采用腹腔注射LPS的方法建立LPS致脓毒症模型。SD大鼠根据检测时点随机分组,LPS组每只大鼠腹腔注射LPS10mg/kg,对照组不进行腹腔注射。经检测,实验组大鼠出现不同程度的心率、呼吸、体温、白细胞增高等全身炎症反应,内毒素血症,以及CRP增高。(二)本研究的设计分为三步:第一步,脓毒症早期线粒体损伤及与脏器功能关系的研究。肾脏是经典的在脓毒症早期即出现组织结构和功能损伤的脏器,其损伤的加剧更可直接或间接影响到其他脏器的功能,进而导致MODS。肾脏内存在多种以ATP为能量基础的离子通道,因此肾脏线粒体损伤将直接影响到肾脏功能。肾上腺是机体在早期发生应激反应、调节机体内分泌的器官,其功能损伤直接关系到脓毒症的的发展进程;且肾上腺作为在脓毒症中的对机体起保护作用的器官,与容易受损的肾脏相比,推测二者抗损伤能力可能存在一定差异。进行脓毒症早期大鼠线粒体超微结构观察和评分、线粒体致密度及膜电位等检测,以判断肾脏和肾上腺线粒体损伤程度,通过血清尿素氮、肌酐及皮质醇分别检测肾脏和肾上腺功能的损伤,通过相关分析探讨线粒体损伤与肾脏和肾上腺功能损伤之间的关系。通过线粒体内氧化应激因子的检测比较肾脏和肾上腺线粒体损伤机制的异同。第二步,脓毒症早期线粒体损伤机制的探讨。脓毒症脑功能损伤的发生一般出现在脓毒症的3小时左右。脑是机体的高级神经中枢,其能量消耗巨大,占全身能耗的20%～25%;而线粒体作为氧化磷酸化的主要场所,是脑能量的最主要来源,其功能对于维持正常的脑功能至关重要。因此,选择脑组织研究脓毒症超早期线粒体损伤的情况,检测血清、脑组织中炎症因子,以及脑线粒体氧化应激因子,通过分析线粒体损伤、炎症因子、氧化应激因子三者之间的相关性,探讨线粒体损伤的发病机制,为寻找早期阻止线粒体损伤的方法提供线索和理论依据。第三步,脓毒症早期线粒体保护的尝试。肝脏是机体进行物质和能量代谢的重要器官,线粒体含量极为丰富。肝脏线粒体功能的正常运行,是机体新陈代谢正常进行的保障。胰岛素是机体进行物质和能量代谢调节的重要激素,可通过各种机制减轻脓毒症早期炎症反应及高代谢、高动力循环状态。因此,我们以持续胰岛素输注脓毒症大鼠,与脓毒症大鼠比较肝脏功能和线粒体的损伤程度、血糖和炎症反应的控制程度,观察脓毒症早期胰岛素治疗对脓毒症时肝脏线粒体的保护作用并探讨其机制,尝试探索早期阻断脓毒症线粒体损伤的途径。(三)本研究主要选取以下检测指标:1.通过线粒体形态学观察和功能检测研究线粒体损伤状态。以电镜观察线粒体形态学变化,Flameng线粒体半定量评分,流式细胞仪检测线粒体致密度。测定线粒体膜电位和线粒体Na~+-K~+-ATP酶活性反映线粒体功能。2.通过线粒体内氧化应激因子以及机体炎症因子的变化研究线粒体损伤机制。氧化应激因子包括Mn-超氧化物歧化酶(Mn-Superoxide dismutase,Mn-SOD)活性、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)浓度、还原性谷胱苷肽(Reducedglutathione hormone,GSH)活性、一氧化氮(Nitric oxide,NO)浓度以及一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase,NOS)活性。炎症因子主要有肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)以及白介素-6(IL-6)。3.通过组织标本大体观察和生化指标检测各脏器结构和功能损伤。以血清尿素氮、肌酐水平反映肾脏功能;以血清皮质醇浓度反映肾上腺功能;以血清转氨酶水平反映肝脏功能。(四)分组:1、脓毒症早期肾脏和肾上腺线粒体损伤及与脏器功能关系的研究。选取脓毒症早期大鼠的肾脏和肾上腺为研究对象,分别代表机体内易受损和对机体起保护作用的两类不同的脏器。30只SD大鼠随机分为对照组、腹腔注射LPS 6h和24h组,比较其脏器功能和线粒体损伤情况,并初步探讨其损伤机制的异同。2、脓毒症早期脑线粒体损伤机制的探讨。40只SD大鼠随机分为对照组、腹腔注射LPS 3h、6h和24h组,研究脓毒症超早期脑组织线粒体损伤的情况,并探讨线粒体损伤的发病机制。3、脓毒症早期肝脏线粒体保护的尝试。24只SD大鼠随机分为正常对照、LPS组和胰岛素干预组。在大鼠腹腔注射LPS后24h观察早期胰岛素治疗对脓毒症时肝脏线粒体的保护作用。[结果]:1、脓毒症早期大鼠肾脏和肾上腺功能及线粒体损伤:脓毒症早期大鼠肾脏功能损伤及线粒体损伤表现为实验组Urea、Cr水平显著升高;电镜下观察线粒体超微结构损伤明显,Flameng线粒体半定量评分增高,线粒体致密度和线粒体膜电位下降,出现线粒体内GSH和iNOs活性增高以及NO浓度减低等氧化应激的因子明显变化;线粒体功能损伤与肾功能损伤密切相关。而脓毒症早期肾上腺功能无明显损伤,随脓毒症时间的发展,实验组较对照组肾上腺系数和血清皮质醇浓度增高;电镜下观察线粒体结构损伤轻微,Flameng评分较对照组无明显改变,线粒体致密度增高,线粒体膜电位下降,但呈可逆趋势,且线粒体内未检测到氧化应激因子的明显变化。2、脓毒症早期脑线粒体损伤及其机制:6LPS组大鼠神经元和小胶质细胞线粒体超微结构评分较正常对照组明显升高,各组星形胶质细胞和少突胶质细胞线粒体超微结构评分较正常对照组无明显差异;3LPS组大鼠脑线粒体膜电位较对照组及其他实验组明显降低,6LPS组和24LPS组较正常对照组无明显差异;脓毒症组大鼠在不同时点出现脑线粒体MDA、NO含量升高及Mn-SOD和NOS活性升高。炎症因子检测方面,大鼠血清3LPS组和6LPS组TNF-α浓度较正常对照组明显升高,各脓毒症组大鼠血清IL-6浓度均明显升高;各脓毒症组大鼠脑组织匀浆TNF-α、IL-1β、IL-6浓度均明显高于正常对照组。相关分析显示,脓毒症大鼠脑组织匀浆TNF-α浓度与脑线粒体Mn-SOD活性呈正相关,与MDA含量呈负相关,IL-1β浓度与脑线粒体MDA含量、NOS活性和NO浓度呈正相关;脓毒症大鼠脑线粒体Mn-SOD活性与脑线粒体膜电位呈明显正相关;MDA含量、NOS活性和NO浓度与脑线粒体膜电位呈负相关;脓毒症大鼠脑组织匀浆TNF-α浓度与脑线粒体膜电位变化正相关,IL-1β浓度与脑线粒体膜电位变化负相关;大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6浓度与脑线粒体膜电位和脑氧化应激因子变化无明显相关性。3、持续胰岛素注射对脓毒症早期大鼠肝脏损伤的保护作用:胰岛素干预组以持续胰岛素输注(0.25U/kg.h),可明显降低过高的血糖水平并维持正常血糖。胰岛素干预组的血清ALT和AST的水平较LPS组显著下降;胰岛素干预组血清TNF-α和IL-6水平较LPS组显著降低;LPS组线粒体轻微损伤,与其相比,胰岛素干预组线粒体形态有所改善;LPS组和胰岛素干预组肝脏线粒体膜电位显著下降,而胰岛素干预组肝脏线粒体膜电位与LPS组相比则显著上升;LPS组和胰岛素干预组肝脏线粒体SOD水平较正常对照组显著升高,胰岛素干预组较LPS组SOD水平显著降低;肝脏线粒体膜电位与血清ALT、AST水平呈负相关,与脓毒症早期血清TNF-α、IL-6水平以及血糖水平呈负相关系。[结论]1、肾脏在脓毒症早期即出现线粒体结构和功能损伤,是肾功能损伤的原因之一,氧化应激机制可能是肾脏线粒体的损伤重要原因;脓毒症早期肾上腺亦发生线粒体损伤,但较轻微,且线粒体内未发生明显的氧化应激反应,提示肾上腺作为机体对抗损伤的应激和保护器官,其自身包括线粒体,在脓毒症的早期亦有较强的抗损伤和修复能力。2、脓毒症早期大鼠脑线粒体存在可逆性功能和结构损伤,脑线粒体功能较结构更易出现损伤性变化;氧化应激是导致脓毒症大鼠脑线粒体功能损伤的重要原因;脓毒症大鼠脑内TNF-α和IL-1β浓度与脑线粒体功能变化存在相关性,TNF-α可能通过多种途径对脑线粒体功能具有保护作用,而IL-1β则可能导致脑线粒体功能损伤。3、脓毒症早期存在肝脏功能及线粒体功能损伤,但线粒体结构尚未发生明显改变,尚处于可逆性阶段;持续胰岛素输注对脓毒症早期大鼠肝脏线粒体有明显的保护作用,此保护作用与其早期降低过高的血糖水平、减轻氧化应激损伤和减轻过度的炎症反应有关。