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我国食管癌发病和死亡人数约占全球的二分之一。放射治疗是目前食管癌主要的治疗手段之一，但是5年生存率仅有10%～30%。研究表明，肿瘤乏氧细胞的产生和存在使肿瘤对放疗的抗拒性增加，是影响肿瘤放射治疗疗效的主要原因之一。乏氧诱导因子-lα（hypoxia inducible factor-1，HIF-lα）是介导肿瘤细胞的乏氧适应性变化的关键调控因子。近年来的研究表明，miR-210作为HIF-1α新发现的下游靶基因，参与了多种细胞生物学功能的调控，如：能量代谢、细胞周期、DNA损伤修复等。已有研究证实，miR-210过表达可引起肿瘤细胞G1/S期和/或G2/M期阻滞，干扰有丝分裂进程，抑制肿瘤生长。其中G1/S期阻滞与miR-210特异性抑制E2F转录因子3（E2Ftranscription factor3， E2F3）和成纤维细胞生长因子受体样因子1（Fibroblast Growth Factor Receptor-like1，FGFRL1）的表达有关。然而目前关于miR-210诱导G2/M期阻滞所涉及的靶基因还鲜有报道，具体调控机制也尚不明了。有研究称原癌基因（c-MYC）的竞争性抑制剂Max结合蛋白（Max’s next tango，MNT）也是miR-210的靶基因，在乏氧条件下，miR-210可以通过抑制它的表达加速细胞周期进程。因此，miR-210调控细胞周期的机制及其对细胞增殖的具体影响都还有待进一步揭示。循环miRNA具有单链小分子特性，多以RNA/蛋白复合体的形式存在，稳定性比其他核酸分子高，RNA酶不易降解，适合作为分子标志物。此前有3项研究分别报道了循环miR-210在胰腺、乳腺、肾脏肿瘤中高表达。尽管上述研究的样本量较小，但结果的一致性表明循环miR-210的差异性表达或可为肿瘤诊断提供帮助。目前还未见食管癌患者循环miR-210表达情况的报道，而且此前的研究多关注于手术对肿瘤患者循环miRNA表达的影响，对于根治性放疗前后循环miRNA表达的变化还鲜有报道。本研究首先观察并检测了人食管鳞癌Eca109细胞在乏氧条件下miR-210的表达情况，通过转染miR-210mimics观察miR-210过表达对Eca109细胞增殖、周期、凋亡的影响，并探讨其可能的作用机制；其次，应用生物信息技术筛选出miR-210调控G2/M期转换的可能靶基因Plk1，通过构建荧光素酶报告质粒pmiR-RB-REPORTTM-Plk1，检验Plk1基因mRNA的3’UTR区域是否包含miR-210的作用结合位点，并检测过表达miR-210对Plk1蛋白表达水平的影响，验证Plk1是否是miR-210的直接靶基因；最后，通过检测食管癌患者及健康志愿者血浆miR-210的表达水平，并对比食管癌患者根治性放疗前后血浆miR-210的表达变化，了解血浆miR-210对食管癌的诊断及放疗疗效评估价值。第一部分miR-210在乏氧食管Eca109细胞中的表达及其对细胞生物学行为的影响目的：检测miR-210在乏氧食管Eca109细胞中的表达水平，并探讨其对细胞增殖、周期、凋亡的影响。方法：RT-PCR检测不同乏氧时相食管鳞癌Eca109细胞中miR-210的表达。采用CCK-8增殖实验、EdU增殖实验、流式细胞仪检测miR-210过表达对Eca109细胞增殖、周期、凋亡的影响结果：经RT-PCR检测， Eca109细胞乏氧培养12h后miR-210的表达就有明显增高，24h后达峰值，较常氧组差异有统计学意义（P<0.001）。CCK-8及EdU细胞增殖实验显示，miR-210mimics转染24、48h后Eca109/miR-210组增殖细胞活力比例均较Eca109/Control组和Eca109/ncRNA组显著下降，差异有统计学意义（P<0.001）。流式细胞分析显示，转染24h后，同Eca109/Control和Eca109/ncRNA相比，Eca109/miR-210组出G2/M期细胞比例明显增高，差异有统计学意义（P<0.05）；转染48h后，Eca109/miR-210组G2/M期增多更为明显（P<0.01）。然而，Eca109/miR-210、Eca109/Control和Eca109/ncRNA三组转染24、48h后细胞凋亡比例未见明显变化。结论：miR-210在乏氧食管Eca109细胞中高表达，miR-210过表达抑制细胞增殖，其机制可能与G2/M期阻滞相关。第二部分miR-210靶向调控Plk1基因表达的研究目的：筛选miR-210调控G2/M期转换的可能靶基因，并验证miR-210对预测靶基因的调控关系。方法：应用生物信息学手段对miR-210的可能靶基因进行预测，经酶切及基因测序鉴定构建含有预测靶基因3’-UTR报告载体pmiR-RB-REPORTTM，应用荧光素酶报告系统检测细胞内荧光活性的变化。WesternBlot检测miR-210对预测靶基因蛋白表达的影响。结果：通过生物信息学预测，筛选Plk1作为miR-210调控G2/M期转换的潜在靶基因。经过酶切及基因测序鉴定，成功构建含有Plk1基因3’-UTR荧光素酶报告载体pmiR-RB-REPORTTM-Plk1。与共转染pmiR-RB-Report_PLK1+mimicsNC相比，HEK293T/17细胞共转染pmiR-RB-Report_PLK1+mimics210后荧光素酶活性显著下（P<0.01）。转染miR-210mimics48h后，对Eca109细胞进行Plk1蛋白的检测，结果提示与Eca109/Control组及Eca109/NC组比较，Eca109/miR-210组Plk1蛋白表达水平显著下降（P<0.01）。结论：miR-210与靶基因Plk1mRNA3’-UTR能够有效结合，miR-210过表达抑制Plk1基因蛋白表达。Plk1是miR-210的直接靶基因。第三部分放疗对食管鳞癌患者血浆miR-210、miR-21表达水平的影响目的：检测食管癌患者血浆miR-210、miR-21表达水平，并评估根治性放疗对血浆miR-210、miR-21表达水平的影响。方法：采集食管癌初治患者根治性放疗前后及健康志愿者血液标本，应用TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR法检测血浆miR-210和miR-21的表达水平。结果：22例初治食管鳞癌患者及15例健康志愿者入组，共采集合格血液样本59份。RT-PCR显示，食管癌组血浆miR-210、miR-21的表达较健康对照组明显升高（P<0.01）。血浆miR-210、miR-21表达水平与食管癌病变位置和分化程度无关。根治性放疗后，食管癌组血浆miR-210、miR-21的表达均显著升高，其中miR-210升高的更为显著（P<0.01，P<0.05）。结论：miR-210、miR-21在食管癌患者血浆中高表达，根治性放疗影响二者的表达水平。