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目的:淋巴细胞活化基因3(Lymphocyte activation gene-3,LAG-3)作为免疫抑制性受体可负调控CD4,CD8等T细胞功能,引起T细胞耗竭。同时表达LAG-3的CD4~+T细胞如I型调节性T细胞(Type I regulatory T cell,Tr1)参与包括体液免疫的负向调控作用。而在丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)感染过程中,LAG-3是否参与负向调控HCV中和抗体应答目前没有报道,因此本研究旨在探讨HCV感染中表达LAG-3的CD4~+T细胞与HCV中和抗体的关系。方法:1.样本纳入与排除标准:收集郴州市有静脉吸毒史的人群血液样本,ELISA法检测血清中的HBV、HDV、HIV及TP感染标记物。纳入标准:根据HCV RNA、抗-HCV抗体(HCV-Ig G)结果将纳入病例分为慢性丙型肝炎感染组(Chronic Hepatitis C virus infection,CHC)(n=40)、HCV自限性感染组(Self-limited HCV infection,SL)(n=30)和健康对照组(Healthy control,HC)(n=36),所有纳入患者跟踪随访至少6个月。排除标准:HBV表面抗原阳性、HIV抗体阳性及TP抗体阳性患者。2.HCV病毒载量与基因分型:使用实时荧光定量PCR检测HCV病毒载量;HCV病毒基因分型通过PCR扩增HCVCore-E1及NS5B序列并通过基因测序确定。3.中和抗体检测:1:100倍稀释的血清样本与表达HCV不同型别膜蛋白(genotype:1a,1b,2a,3a,4a,5a)的假病毒共同孵育后感染Huh7.5细胞,血清中和活性即血清对病毒感染的相对抑制率。4.免疫细胞检测与分析:流式细胞分析外周血CD4~+T细胞的LAG-3表达,I型调节性T细胞(Type I regulatory T cell,Tr1),调节性T细胞(Regulatory T cell,Treg)及滤泡辅助性T细胞(T follicμLar helper cell,Tfh)频率。5.相关性分析:(1)LAG-3~+CD4~+T,Tr1,Treg及LAG-3~+Treg与Tfh细胞及中和抗体相关分析;(2)Tfh细胞与中和抗体相关分析。结果:1.HCV感染过程中LAG-3在CD4~+T细胞上表达上调:通过对三组中LAG-3~+的CD4~+T细胞分析发现:HCV慢性感染组和HCV自限性感染组LAG-3~+CD4~+T细胞表达水平明显高于健康对照组(分别为P=0.020、P=0.035)。由于LAG-3~+CD4~+T细胞存在负性调节功能,由此我们进一步分析LAG-3~+相关的CD4调节性T细胞:Tr1(CD4~+CD45RA~-CD49b~+LAG-3~+)和LAG-3~+Treg(CD4~+CD25~+Foxp3~+LAG-3~+)在HCV感染中的变化,发现在HCV自限性感染组的Tr1和LAG-3~+Treg细胞水平要明显高于健康对照组(分别为P=0.034、P=0.011),而HCV慢性感染组与其他两组之间并无明显差异。提示HCV感染会驱动LAG-3~+的调节性T细胞增加。2.LAG-3~+CD4~+T与HCV中和抗体呈负相关:LAG-3作为负性调控因子会在HCV慢性感染中引起细胞免疫的功能下降,我们进一步分析LAG-3与中和抗体关系发现:在HCV慢性感染与HCV自限性感染中,LAG-3~+CD4~+T细胞频率与中和抗体反应呈显著的负相关关系(分别为R=-0.446,P=0.007、R=-0.693,P<0.001)。进一步分析LAG-3~+Treg而不是Treg同样显示与中和抗体的负相关性(R=-0.418,P=0.038和R=-0.615,P=0.004)。提示,LAG-3~+的CD4 T细胞在HCV感染中可能参与负向调控中和抗体反应。3.滤泡辅助性T细胞在HCV感染中与中和抗体的关系Tfh细胞是长效广谱中和抗体产生所必需的一类辅助性CD4~+T细胞,我们分析Tfh及亚群与中和抗体的相互关系发现:HCV自限性感染中CXCR3~+Tfh细胞频率与HCV中和抗体的产生正相关(R=-0.646,P=0.004),表明CXCR3~+Tfh细胞可能作为主要的Tfh细胞参与中和抗体的生成。4.HCV感染中上调的LAG-3~+CD4~+T与CXCR3~+Tfh相关分析HCV感染中LAG-3在CD4~+T细胞表达上调,其与中和抗体呈负向关系,而发现CXCR3~+Tfh细胞与中和抗体呈正相关关系。因此,我们进一步分析了LAG-3~+CD4~+T细胞与CXCR3~+Tfh细胞之间的关联。结果显示:HCV自限性感染中CD4~+LAG-3~+T细胞与CXCR3~+Tfh细胞呈显著负相关(R=-0.608,P=0.006)。提示CD4~+LAG-3~+T细胞可能影响CXCR3~+Tfh细胞而影响HCV中和抗体反应。结论:HCV感染驱动LAG-3表达上调,并引起循环Tfh细胞向CXCR3~+Tfh细胞分化;HCV感染自行恢复人群中LAG-3~+CD4~+细胞频率与CXCR3~+Tfh细胞频率以及HCV中和抗体水平负相关,而CXCR3~+Tfh细胞频率与HCV中和抗体水平正相关。提示LAG-3免疫抑制性受体可能通过负向调控CXCR3~+Tfh细胞,从而影响HCV中和抗体免疫应答。