一、研究目的抑郁症是一类严重危害人类身心健康的常见疾病。其终生患病率高达15%-20%,对人类危害极大。目前临床使用的抗抑郁剂大多是基于抑郁症发病机制的单胺递质假说而研发的,存在着一些明显的缺陷。鉴于此,寻求新的抗抑郁剂研发策略十分必要。大量研究表明,抑郁症患者存在着明显的生物节律尤其是昼夜节律紊乱,如睡眠障碍,以及部分激素、神经递质及细胞因子等合成、分泌、代谢的昼夜节律失调。由此可见,生物节律的紊乱可能是抑郁症发病机制的一个重要组成部分本课题组早期实验证实,调肝方药加味四逆散具有确切的抗抑郁效应。在此基础上,结合中医时间医学分时给药的理论基础,在宏观上将抑郁症昼夜节律失调和中医肝主疏泄、调畅情志理论以及天人相应、阴阳平衡理论结合起来,采用调肝方药加味四逆散卯时、酉时分时给药的方法,从调节机体昼夜节律角度,探讨其抗抑郁的作用机理。这种研究可作为中药复方抗抑郁研究的一个探索,并为临床用药提供可靠的药理学依据,从而减少传统中医用药中存在的局限性和盲目性,使中药治疗抑郁症病理改变的针对性更强。同时,本研究也将在一定程度上揭示中医时间医学中分时给药理论的科学内涵。二、研究方法1.CMUS动物模型的建立SPF级SD大鼠80只,雄性,体重150g-180g,自由摄食饮水,在光暗周期为12h,温度为23±2℃的安静环境适应两周后,根据糖水消耗实验结果和体重情况分为8组,每组10只。造模采用Willner P慢性轻度不可预计应激动物模型,并加以修改。接受应激处理的组别大鼠与空白组大鼠分房饲养,在21天接受不同应激源的刺激,应激源包含有狭小空间(束缚)、45。斜笼、湿笼、新入侵者(并笼)、持续光照、禁食、禁水、空瓶。于造模周期结束后,对所有实验动物进行糖水消耗实验,并称量体重,通过前后对比分析判断模型建立情况以及各给药组别的抗抑郁效应。2.药物处理在造模的同时,即开始对各组别大鼠进行不同的药物处理,其中,空白组(不灌胃、不施加任何刺激)、模型组(每天7：30灌胃双蒸水,3ml／只、施加刺激)、JWSNS卯时组(每天7：30灌胃中药JWSNS,3ml/只、施加刺激)、JWSNS酉时组(每天17：30灌胃中药JWSNS,3ml/只、施加刺激)、JWSNS卯酉分时组(每天7：30、17：30分别灌胃中药JWSNS,1.5ml/只、施加刺激)、双蒸水卯酉分时组(每天7：30、17：30分别灌胃双蒸水,1.5ml/只、施加刺激)、MT清晨组(造模前期每天7：30灌胃双蒸水,后期每天7：30灌胃MT溶液,3ml/只、施加刺激)、MT傍晚组(造模前期每天17：30灌胃双蒸水,后期每天17：30灌胃MT溶液,3ml/只、施加刺激)。其中空白组与其他各组分房饲养。3.指标的检测体温：在末次糖水消耗实验结束后三天内,对所有大鼠进行昼夜24小时的体温检测,每四小时一次,检测时间点分别为10：00、14：00、18：00、22：00、2：00和6：00。将所得数据进行拟合,得出各组大鼠体温变化的余弦方程,并对其体温中值、峰值、谷值、振幅以及峰值时间、谷值时间进行比较,观察不同处理对大鼠24小时体温节律的影响。激素神经递质：在体温检测结束后三天内,对所有大鼠进行昼夜24小时的眶下静脉丛乙醚麻醉下采血,每四小时一次,采集时间点分别为10：00、14：00、18：00、22：00、2：00和6：00。血液采集结束立即离心,取血清部分-20℃冻存备用。采血结束后七天内,对所得样本进行酶联免疫吸附试验(ELISA),检测其血清中5-羟色胺、褪黑素、皮质酮含量,并将所得数据进行拟合,得出此三种物质昼夜变化的余弦方程,并对其血清浓度的中值、峰值、谷值、振幅以及峰值时间、谷值时间进行比较,观察不同处理对大鼠24小时5-羟色胺、褪黑素、皮质酮节律的影响。三、实验结果1.成功建立大鼠CMUS实验动物模型实验结果显示,模型组大鼠表现为体重增长缓慢和糖水偏爱度的显著下降(P<0.01)。且在整个实验周期的第22天左右,模型组动物开始出现典型的毛无光泽、竖毛现象,其余除正常组外各组毛色也较之前晦暗。据此认定CMUS动物模型复制成功。2.调肝方药加味四逆散及阳性药物褪黑素抗抑郁行为效应在体重变化方面,阳性药物褪黑素清晨、傍晚给药对CMUS造成的大鼠体重下降有抑制趋势,且此种作用优于加味四逆散各给药组别；且加味四逆散卯酉分时给药优于卯时给药优于酉时给药。考虑为药物本身的质地、口感及单次灌胃量等因素对动物的食欲的影响以及灌胃时的机械刺激对大鼠的影响,进而影响其体重的增加。在糖水偏爱度的变化方面,方药加味四逆散卯时、酉时、卯酉分时给药以及褪黑素清晨、傍晚给药均可以抑制由对慢性应激带来的糖水偏爱度下降。因此得出结论,调肝方药加味四逆散卯时、酉时、卯酉分时给药以及阳性药物褪黑素清晨、傍晚给药均具有抗抑郁效应。3.慢性应激带来的体温及激素神经递质的改变对于本实验检测的四个指标——体温、血清5-羟色胺含量、血清褪黑素含量、血清皮质酮含量。研究结果显示,在正常情况下,大鼠体温呈现昼夜节律变化,其中光时相(白昼)体温较低,暗时相(夜间)体温较高,体温谷值出现在9：00左右,峰值出现在与之相对应的21：00左右,昼夜体温波动范围在(0.2-0.6)℃之间。CMUS可导致实验大鼠昼夜24小时平均体温下降,峰值抬高,谷值降低,体温波动幅度变大,时相推后。血清5-羟色胺、褪黑素、皮质酮含量同样存在着昼夜节律的变化,三者表现为大致相同的波动规律,都是光时相(白昼)含量较低,暗时相(夜间)含量较高。其中,5-羟色胺和皮质酮的血清浓度峰值大致出现在21：00左右,谷值出现在9：00左右,褪黑素的时相向后延迟约一个小时,峰值时间出现在22：00左右,谷值时间出现在10：00左右。在慢性应激状态下,实验大鼠表现出血清5-羟色胺和褪黑素整体水平的下降,波动幅度减小,节律性减弱以及时相的大幅度提前,甚至出现昼夜节律的颠倒；而血清皮质酮则表现为整体水平的升高,波动幅度减小,节律性减弱以及时相的大幅度提前。4.阳性药物褪黑素抗抑郁机理的推断实验结果显示,在调节由慢性应激带来的体温及激素神经递质改变方面,褪黑素清晨给药组表现为对体温振幅的调节和对5-羟色胺、皮质酮时相的调节,而对含量改变不明显。具体表现为通过调节夜间体温(峰值)使体温波动幅度减小,更接近正常值；使5-羟色胺分泌时相、皮质酮分泌时相更接近空白组。褪黑素傍晚组表现为对体温振幅、时相的调节,对5-羟色胺含量、振幅的调节和对皮质酮含量的调节。具体表现为使体温振幅减小,时相提前；使5-羟色胺含量增加,节律性更加明显；使皮质酮含量减少。纵观褪黑素作用的大体趋势,以对生物节律(振幅、时相)的调节为主。因此可以做出推断,阳性药物褪黑素主要是通过调节时间节律来达到抗抑郁效果的。5.方药加味四逆散各给药组抗抑郁机理的推断对于由慢性应激带来的体温及激素神经递质改变的调节,方药加味四逆散三个给药组别中：卯时给药主要通过改变时间节律来达到抗抑郁的作用。表现为对体温时相、血清5-羟色胺和血清褪黑素分泌时相的调节,而对其含量几乎没有影响；具体表现为对于CMUS作用下实验大鼠24小时体温峰值时间、谷值时间的延迟性改变起到抑制作用,从而其时相更加接近于空白组；并对慢性应激带来的血清5-羟色胺、褪黑素时相的大幅度提前有调节作用,使其时相更加接近于空白组。酉时给药主要通过改变激素分泌量来达到抗抑郁的作用。首先在体温方面,酉时给药主要通过对昼夜体温(峰值、谷值)的双向调节达到使体温波动幅度减小的结果,从而使其体温变化更接近正常值。在对激素神经递质的调节方面,酉时给药均能对慢性应激带来的大鼠5-羟色胺、褪黑素、皮质酮含量波动不明显,节律性减弱这一现象起到一定的抑制作用。并可调节血清中5-羟色胺、褪黑素的量,抑制其含量的降低,调节血清中皮质酮水平,抑制其升高。卯酉分时给药的抗抑郁效应则是通过改变激素分泌量和调整其节律性两方面起作用的。体温方面,卯酉分时给药主要通过对日间体温(谷值)使体温波动幅度减小,更接近正常值。在对激素神经递质的调节方面,卯酉分时给药能抑制血清5-HT含量的降低,抑制血清皮质酮水平的升高,并对5-羟色胺、皮质酮的振幅起到调节作用,使其波动更接近空白组。此外,卯酉分时给药还起到调整褪黑素、皮质酮时相变化的作用。因此可以认为,对于方药加味四逆散来讲,卯时给药主要是通过调整时间节律来达到抗抑郁效果的,而酉时给药主要是通过调整激素神经递质的分泌量来达到抗抑郁效果的,卯酉分时给药则同时从调整激素神经递质分泌量和调整时间节律两个方面来发挥其抗抑郁的效应。四、研究结论本研究所得结论如下：1.慢性应激性抑郁症可以带来生物体昼夜节律的紊乱,包括体温整体水平的降低、波动幅度的加大、时相的延迟；血清5-羟色胺、褪黑素水平的降低,节律性的减弱,时相的提前；血清皮质酮水平的升高,节律性的减弱,时相的提前。2.方药加味四逆散卯时、酉时、卯酉分时给药以及褪黑素清晨、傍晚给药等各治疗组都有明显的抗抑郁效应。3.阳性对照药物褪黑素主要是通过调节时间节律来达到抗抑郁效果4.调肝方药加味四逆散卯时给药主要通过调整时间节律来达到抗抑郁效果5.调肝方药加味四逆散酉时给药主要通过改变激素分泌量来达到抗抑郁效果6.调肝方药加味四逆散卯酉分时给药主要通过改变激素分泌量和调整其节律性两方面达到抗抑郁效果综上所述,可认为调肝方药加味四逆散对慢性应激性抑郁症带来的体温及血清激素水平昼夜节律的紊乱具有调节作用。其不同时间点给药作用机制有所不同,卯时给药主要通过改变时间节律来达到抗抑郁效果,酉时给药主要通过改变激素分泌量来达到抗抑郁效果,卯酉分时给药主要通过改变激素分泌量和调整其节律性两方面达到抗抑郁效果。而目前应用于调节抑郁症生物节律紊乱的药物褪黑素,其作用机理与加味四逆散卯时给药相类似,主要通过改变时间节律来达到抗抑郁效果。