论文部分内容阅读
多发性骨髓瘤(Multiple myeloma ,MM)是浆细胞恶性增殖性疾病,其特点是恶性浆细胞在骨髓微环境中不规则积聚引起溶骨性骨破坏、肾功能损害、贫血、高钙血症和感染等临床表现,占血液科肿瘤的10%-15%左右。尽管在过去的几十年中有关MM发病机制、诊断和治疗的研究取得了较大的进展,但是仍然有许多重要的问题悬而未解。目前MM仍是一种不可治愈的血液系统恶性肿瘤,MM的发病机制复杂,近年主要集中在细胞遗传学异常、骨髓微环境与骨髓瘤细胞相互作用、NF-kB及Notch信号通路和耐药机制几方面。大量研究表明骨髓微环境在骨髓瘤细胞的生长、存活、耐药及归巢中起重要作用。【目的】:研究骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)及成骨细胞(Osteoblasts, OBs)与MM细胞在体外共培养过程中,对MM细胞体外生长增殖、凋亡、自噬的影响,探讨骨髓微环境变化对MM细胞增殖、迁移及生物学行为的影响,为MM临床治疗提供新的理论依据和实验基础。【方法】:分离绿色荧光(GFP)小鼠长骨,冲出骨髓并接种于培养瓶,取第3代绿色荧光间充质干细胞,MTT法绘制细胞的生长曲线,流式细胞仪检测其细胞周期及表面标记物的表达,并用VonKossa试剂盒鉴定细胞的成骨分化能力。取第三代GFP-MSCs及成骨细胞株与IL-6依赖的人多发性骨髓瘤细胞株XG-7的共培养,通过PI法、Annexin V/PI双标记法及MDC(单丹磺酰尸胺)观察直接共培养、间接共培养(Transwell)前后XG-7细胞数量、细胞周期、凋亡、及自噬变化。我们以CD138分子标记XG-7,共聚焦显微镜动态检测XG-7与MSCs、OB直接接触后变化;加入胆固醇消耗剂甲基β环糊精破坏膜的完整性后,观察CD138标记的XG-7的变化。【结果】:分离培养的GFP-MSCs具有较强的增殖能力和较高的成骨细胞分化潜能,表型分析显示MSCs不表达CD34、CD45等造血细胞表面标志,低表达CD106,高表达CD29及间充质干细胞表面标志CD105等。GFP-MSCs及OBs与XG-7细胞直接和间接共培养后,促进MM细胞生长,其抗凋亡能力增强,处于S期的细胞较多,增殖活性强,共聚焦显微镜观察其抗无血清诱导自噬能力增强。共培养条件下,PE标记的CD138在MM细胞胞膜上呈现极化状态,其中多数XG-7细胞是以极化的胞膜区同OB或MSCs接触,加入甲基β环糊精破坏胞膜的流动性后,极化现象消失。【结论】:本实验成功的在体外建立一种简便可行的GFP-MSCs培养扩增方法,进而得到一种高表达绿色荧光的MSCs,且该绿色荧光蛋白不影响MSCs生物学功能,能够持久稳定表达,多次传代其荧光强度也无明显变化,是较为理想、方便、高效的示踪工具,为下一步研究造血干细胞移植的显微解剖关系带来了方便。MSCs及OBs增强XG-7细胞抗凋亡及抗自噬的能力,并可促进XG-7细胞的生长,对其生存增殖起到庇护作用;MM细胞可通过极化的粘附分子延长与骨髓基质细胞的接触时间,提示二类细胞密切接触是保护MM细胞免受凋亡诱导剂作用的重要基础,为进一步阐明MM发病机制、探索MM新的临床治疗靶点提供理论和实验基础。