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研究背景:化疗药物引发的心脏毒性一直是临床上备受关注而难以解决的问题,其中蒽环类药物剂量依赖的心脏毒性在临床上具有较高的发生率和致残致死率,限制了其在临床上的广泛应用。随着医疗水平和治疗手段的改善,癌症患者的生存率逐年增加。然而,蒽环类化疗药物引发的心律失常、心肌损伤等心脏毒性问题仍是威胁癌症患者健康的隐患,甚至患者在接受化疗后几年到十几年内仍可发生心脏功能障碍。通过对蒽环类药物引发心脏毒性问题的作用机制进行深入探讨,针对心脏保护开展对应策略研究成为研究者们不断前进的方向。多柔比星(doxorubicin,DOX)引发的心脏损伤是多分子多因素共同参与的病理过程。目前,DOX诱发心脏毒性的机制尚不明确。血管内皮细胞位于血管腔内侧,构成了血管内物质和外界交流的屏障,其紧密连接结构的完整以及转运和代谢过程的正常运作,是维持血管稳态的重要因素。血管内皮细胞是许多化疗药物毒性作用靶细胞的理念也被越来越多的研究所证明。关于DOX引发心脏毒性的作用过程中,血管内皮细胞的损伤状况、毒性机制和分子信号的变化规律等尚不清楚。研究目的:本研究以化疗药物DOX诱发血管内皮细胞外泌体分泌障碍为切入点,了解血管内皮细胞在DOX导致的心脏毒性病理进程中的损伤状况,并通过一系列药理学手段对其损伤机制进行深入探讨,揭示外泌体代谢途径在DOX导致的血管内皮细胞损伤中的作用。为临床解决DOX导致的心脏毒性提供新的依据和思路。实验方法和结果:本研究首先通过CCK-8、免疫印迹、免疫荧光等分子生物学方法检测DOX对血管内皮细胞活力以及血管内皮细胞紧密连接状态的影响,确认DOX导致血管内皮细胞毒性的损伤表型。为了进一步了解DOX导致血管内皮细胞损伤的机制,本研究采用转录组学分析考察DOX导致血管内皮细胞损伤前后的差异基因,发现这些基因显著富集于细胞转运和代谢过程,提示这一过程可能在DOX诱发的血管内皮细胞毒性中发挥关键作用。在后续的研究中,我们聚焦于转运和代谢过程中的外泌体代谢途径,首先通过密度梯度超速离心法提取等量细胞上清中的外泌体,确认DOX导致血管内皮细胞外泌体释放量下降。基于这一实验结果,我们从外泌体的生成和分泌两个环节进一步探究详细的作用机制。一方面,构建 CD63-EGFP,Rab5-RFP 和其点突变 Rab5Q79L-mCherry 质粒,并筛选得到HEK293 CD63-EGFP稳定表达细胞株,借助免疫荧光、免疫印迹等分子生物学手段,系统研究了外泌体在细胞内的生物起源MVBs的亚细胞状态。实验结果显示,DOX诱发MVBs粒径变大,绕核成簇分布,表明囊泡蛋白发生聚集;然而DOX未影响MVBs标志蛋白CD63和位于早期内含体的Rab5共定位。因此,我们推测,DOX并非通过影响外泌体蛋白分选进入早期内含体这一过程引起血管内皮细胞外泌体代谢途径损伤。生物信息学分析结果显示,DOX是通过抑制小GTPase家族的Rab27b蛋白表达,阻断MVBs锚定到细胞膜,从而导致外泌体不能释放到细胞外,细胞的转运和代谢过程不能正常运转。使用外泌体抑制剂GW4869和DOX共同处理血管内皮细胞后发现聚集在细胞内的蛋白加剧细胞凋亡。为了逆转DOX导致的血管内皮细胞凋亡,本研究尝试采用褪黑素(melatonin)对其毒理过程进行调控,免疫印迹的结果显示,褪黑素并未直接影响Rab27b的蛋白表达水平,而是通过降低DOX导致的血管内皮细胞凋亡,逆转DOX对血管内皮细胞的毒性作用。结论:DOX诱发的心脏毒性中也会对血管内皮细胞产生毒性,破坏紧密连接,诱发凋亡事件;DOX抑制Rab27b蛋白的表达水平,损伤外泌体代谢途径;而褪黑素通过调控凋亡通路相关蛋白和血管内皮细胞紧密连接蛋白,但并未直接调控Rab27b的表达水平,对DOX诱发的血管内皮细胞的毒性进行有效缓解。