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目的:以杜仲药材有效部位提取物为研究对象,在细胞水平上考察其抗骨质疏松药效作用,阐明杜仲药材抗骨质疏松作用的药效物质基础及作用机制。方法:(1)采用大孔树脂吸附法分离杜仲化学组分并用高效液相(UPLC)进行图谱比对以探究组分制备的合理性;以对MC3T3-E1 subclone 14成骨细胞及SAO-2人成骨细胞存活率、碱性磷酸酶活性、骨保护素(OPG)活性的影响,筛选杜仲抗骨质疏松有效活性组分(2)在杜仲各化学组分UPLC图谱比对的基础上,借助超高液相色谱–电喷雾–串联质谱(UPLC-ESI-MS/MS)联用技术对杜仲促成骨细胞增殖有效组分的化学成分进行质谱分析研究。(3)采用MC3T3-E1subclone 14成骨细胞存活率来筛选杜仲有效活性化学成分,然后应用实时荧光定量PCR技术和Western blot(蛋白质印迹)技术从分子水平研究杜仲有效部位中的主要化合物对MC3T3-E1 subclone 14成骨细胞中OPG,RANKL,RUNX-2,Osterix及TRACP等基因表达的影响,同时使用酶联免疫法检测杜仲有效组分中的主要化合物对MC3T3-E1 subclone 14成骨细胞中Ca2+,ALP,M-CSF及OTC等因子活性的影响。结果:通过比对杜仲各化学组分高效液相(UPLC)图谱发现水煎煮提取法明显优于乙醇回流提取法,水煎煮提取物经D101大孔树脂分段后各组分基本无交叉。杜仲水提取物经D101大孔树脂分离所得40%乙醇组分对成骨细胞具有促进增殖、促分化成熟及促进OPG分泌水平的作用。利用超高液相色谱–电喷雾–串联质谱(UPLC-ESI-MS/MS)联用技术对40%乙醇组分进行质谱分析比对,共指认10个化合物:京尼平苷酸、原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄苷、刺五加苷E、松脂醇单葡萄苷、紫云英苷、黄芩苷。分子生物学实验结果表明,京尼平苷酸、咖啡酸、紫云英苷、黄芩苷具有促成骨细胞增殖的作用并且能显著提高Ca2+、ALP、M-CSF及OTC因子的表达,具有促进成骨细胞成熟分化的能力。紫云英苷、黄芩苷能促进Ca2+及OTC的分泌。4个化合物中只有京尼平苷酸能明显抑制M-CSF因子减少成骨细胞的转换。Western blot实验结果表明,紫云英苷、黄芩苷、咖啡酸和京尼平苷酸能显著的上调OPG/RANKL系统的表达。黄芩苷、紫云英苷还能提高RUNX-2蛋白的阈值,同时Osterix蛋白水平也随着黄芩苷浓度升高而显著上升。利用RT-PCR方法对成骨细胞TRACP因子考察发现,京尼平苷酸能浓度依赖性的抑制TRACP因子的活性。结论:杜仲40%乙醇组分是促成骨细胞增殖及分化成熟活性组分,该组分中的化合物紫云英苷、黄芩苷、京尼平苷酸和咖啡酸是杜仲抗骨质疏松的活性成分。京尼平苷酸、紫云英苷、黄芩苷、咖啡酸具有显著性的提高成骨细胞分化成熟的能力并且京尼平苷酸还能抑制成骨细胞转化为破骨细胞,维持成骨细胞与破骨细胞的平衡。同时京尼平苷酸、紫云英苷、黄芩苷、咖啡酸能上调OPG/RANKL系统改善骨重建;紫云英苷、黄芩苷加强钙离子与骨组织的结合能力辅助改善骨重建以到达改善骨质疏松症的目的。综上所述,本研究初步阐明了杜仲药材抗骨质疏松的药效物质基础,并对其抗骨质疏松的机制进行了初步研究,为杜仲药材的开发应用提供了实验依据。