无肋马尾藻生物活性肽的研究

来源 :上海海洋大学 | 被引量 : 2次 | 上传用户:jiaoyang_204
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从无肋马尾藻(Sargassum fulvellun)分离得到的水溶性物质经半透膜(MWCO: 10KD)透析,透析后的物质采用葡聚糖凝胶(Sephadex G-75)进行纯化,通过TLC和Tricine-SDS-PAGE确认了纯化的效果。清洗干净的干燥无肋马尾藻200 g切成0.5 cm长,在室温(25℃)、10 r/min的条件下用5倍量的去离子水提取水溶性物质12 h。获得的提取液在10000 rpm、4℃、10 min的条件下离心得到上清液,上清液在60℃的条件下被减压浓缩至50 ml,经截留分子量为10 KD的半透膜透析后,透析后的物质被用层析柱葡聚糖凝胶Sephadex G-75和流动相去离子水、去离子水-甲醇(3:2)、10 mmol.L-1磷酸盐缓冲液洗脱,10 mmol.L-1磷酸盐缓冲液的洗脱效果最优,纯化的物质在以甲醇-乙酸乙酯为展开剂、用茚三酮染色的薄层层析上显示出一个斑点,在Tricine-SDS-PAGE呈现唯一条带。从200 g无肋马尾藻经提取、离心、浓缩、透析、层析、冷冻干燥得到纯化的无肋马尾藻肽14.6 g,该无肋马尾藻肽暂定名为SFPP (Sargassum fulvellun polypeptide)。研究了SFPP的生物化学特性,发现SFPP的分子量约为17 KDa、热变性温度为51.4℃、具有特征性的氨基酸构成。采用在分离胶中加入尿素的Tricine-SDS-PAGE方法,用银染色测定出SFPP的分子量约为17 KDa;通过差式扫描量热法测定SFPP的热变性温度是51.4℃;应用氨基酸分析仪分析了SFPP的氨基酸组成。其含有较高含量的天门冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Gly)和赖氨酸(Lys),和其他海藻肽的氨基酸构成具有明显差异。没有检测出SFPP的氨基酸序列。通过研究SFPP作用大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞(PC12)、大鼠骨髓基质细胞(BMSCs)和脊髓细胞三种体外培养的细胞来研究SFPP的生物活性作用。SFPP与无肋马尾藻的粗提物均能促进大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞(PC12)增殖作用和神经分化作用,并且存在相似趋势的剂量依赖性。SFPP与NGF能够对促进大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞(PC12)神经分化作用并产生协同效应。在第3代PC12细胞培养体系中分别单独添加5组不同剂量(50ug/mL、100ug/mL、150ug/mL、200ug/mL、250ug/mL)的SFPP与无肋马尾藻的粗提物和空白对照组,应用MTT检测法检测到从50ug/mL到150ug/mL的浓度时SFPP与无肋马尾藻的粗提物均能促进PC12增殖,并且随添加浓度的增加PC12增殖呈现上升趋势,当浓度为150ug/mL时PC12活性值达到最高。从150ug/mL到250ug/mL则PC12增殖呈现下降趋势。通过倒置电子显微镜观察SFPP能促进PC12神经分化,仍然存在相同趋势的剂量依赖性。单独添加5组不同剂量浓度(5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL)的NGF与空白对照组比较,NGF能够促进PC12神经分化,存在剂量依赖性,从5ng/mL到20ng/mL的浓度时NGF能促进PC12神经分化,并且随添加浓度的增加PC12分化程度呈现上升趋势,当浓度为20ng/mL时分化率达到最高值。从20ng/mL到25ng/mL则PC12分化率呈现下降趋势。20ng/mL浓度的NGF与5组不同浓度剂量组的SFPP共同作用,检测到对PC12分化存在剂量依赖性和协同作用。SFPP能够促进第3代大鼠骨髓基质细胞(BMSCs)和脊髓细胞增殖,并存在剂量依赖性。正常饲养SD大鼠2周,分离大鼠骨髓基质细胞(BMSCs)和脊髓细胞,原代培养后传代到稳定的第3代,添加5组不同剂量(50ug/mL、100ug/mL、150ug/mL、200ug/mL、250ug/mL)的SFPP,并比较L-DMEM和RPMI-1640两种不同完全培养对他们增殖的影响。应用MTT检测法检测SFPP对骨髓基质细胞(BMSCs)和脊髓细胞存在增殖作用,并呈现剂量依赖性。从10ug/mL到50ug/mL的浓度时骨髓基质细胞(BMSCs)增殖呈现上升趋势,当浓度为50ug/mL时增殖达到最高值。从50ug/mL到250ug/mL则呈现下降趋势。脊髓细胞的增殖体系中叶存在剂量依赖趋势,SFPP浓度为100ug/mL的剂量组是促进脊髓细胞增殖的最佳剂量。L-DMEM培养基对骨髓基质细胞(BMSCs)的增殖率比RPMI-1640高,但在脊髓细胞培养体系中两种培养基脊髓细胞的增殖效果却是相反的。通过无肋马尾藻中活性肽生物活性的研究,希望能为从细胞分子方向来治疗脑神经疾病提供帮助。
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