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柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing,HLB)是由韧皮部限制性难培养革兰氏阴性细菌引起的世界柑橘产业上的毁灭性病害。肽聚糖相关脂蛋白(Peptidoglycan-associated lipoprotein,Pal)属于细菌外膜蛋白,在许多革兰氏阴性菌的致病过程中发挥重要作用。该课题在本实验室前期研究的基础上,对具有效应子功能的Pal基因进行了深入研究,取得的主要研究成果如下:1. Pal系列基因突变体感染本氏烟草表型分析:本研究采用Gateway技术分别成功构建了Pal跨膜区基因突变体△Pal6th(aa7-161)、 △Pal7th(aa8-161)、 △Pal8th(aa9-161) 、△Pal9th(aa10-161)、△Pal10th(aa11-161) △Pal11th(aa12-161)、 △Pal7th(Phe-Gly)、 △Pal8th(Ile-Ala)、△Pal9th(Ile-Ala)和△PAl10th(Leu-Gly)基因的入门载体pDONRTM/Zeo及植物表达载体pSK103,热击转化至根癌农杆菌GV3101后诱导接种至本氏烟草,其中△Pal6th(aa7-161)-103、△Pal7th(aa8-161)-103 和△Pal7th (Phe-Gly)-103 能成功诱导本氏烟草产生过敏性坏死反应,在6dpi时局部坏死非常明显,至12dpi时烟草组织已经完全坏死,而其他缺失突变体和定点突变体基因并未引起本氏烟草的HR反应,由此表明第八个氨基酸异亮氨酸(IIe)为引起本氏烟草HR反应的主要氨基酸。2.Pal基因系列突变体在本氏烟草中亚细胞定位分析:将构建成功的Pal跨膜区基因突变体入门载体△Pfl7th(aa8-161)Zeo、△Pal8th(aa9-161)- Zeo、△Pal7th (Phe-Gly)- Zeo和△Pal8th (Ile-Ala)- Zeo构建至植物表达载体pMW390,经农杆菌诱导接种至本氏烟草48h后观察荧光定位信号,结果表明:△Pal7th(aa8-161)-390、△Pal8th(aa9-161)-390、△Pal7th(Phe-Gly)- 390和△Pal8th(Ile-Ala)-390在本氏烟草细胞质膜处均存在荧光信号,同时,△Pal7th(aa8-161)-390和△Pal7th(Phe-Gly)- 390在细胞核处也存在荧光信号,△Pal8th(aa9-161)- 390和△Pal8th(Ile-Ala)- 390未发现细胞核荧光定位信号。3.Pal基因系列突变体引起本氏烟草胼胝体沉积和氧爆发试验分析:将构建成功的Pal基因跨膜区突变体△Pal7th(aa8-161)-103、△Pal8th(aa9-161)-103、△Pal7th (Phe-Gly)-103和△Pal8th(Ile-Ala)-103接种至本氏烟草,在荧光显微镜下可观察到△Pal7th(aa8-161)-103和△Pal7th(Phe-Gly)-103在24-48 h能诱导本氏烟上胼胝体的大量积累,同时采用DAB染色在接种本氏烟草0.5-5h的时间段内,H2O2的积累也迅速提升,表明Pal基因跨膜区第八位氨基酸异亮氨酸对于Pal基因诱导本氏烟草防卫反应发生起关键作用。4.Pal基因系列突变体引起红心柚防卫基因表达分析:将构建成功的Pal基因跨膜区突变体△Pal7Th(aa8-161)-103、△Pal8th(aa9-161)-103、△Pal7th (Phe-Gly)-103 和△Pal8th(Ile-Ala)-103 接种至红心柚,观察到△Pal7tth(aa8-161)-103 和 △Pal7th (Phe-Gly)-103 基因可引起红心柚叶片接种口附近产生明显黄化症状,其他突变体及对照均不存在黄化表型。通过荧光定量PCR技术检测红心柚中6个HR标志基因表达情况表明△Pal7th(Phe-Gly)-103和△Pal8th(Ile-Ala)-103基因均能引起红心柚防卫基因不同程度的表达变化。△Pal7th(Phe-Gly)-103基因诱导PR1在8 dpi时上调表达5倍、EDS1在5dpi时上调表达6倍、WRKY1及PAL1在5 dpi时上调表达1.5倍、NPR3在8dpi时上调表达4倍。与△Pal7th(Phe-Gly)-103基因相比,△Pal8m(Ile-Ala)-103基因在5dpi-8dpi时诱导HR标志性基因PR1、NPR3及EDS1相差了约3倍,可见△Pal7th(Phe-Gly)-103基因启动了红心柚PTI免疫反应。5.Pal基因系列突变体在E.coli中亚细胞定位分析:利用不依赖于连接反应克隆(LIC)技术成功构建了原核表达载体△Pal7th(aa8-161)-GFP、△Pal8th(aa9-161)-GFP、△Pal7th (Phe-Gly)-GFP及△Pal8th(Ile-Ala)-GFP 基因并于 28℃,0.1 mmol/L IPTG 条件下诱导5h后,对菌液进行处理,激光共聚焦观察黄龙病菌Pal基因四个不同突变体目标融合蛋白在E.coli中分布相同,均呈现单极性分布,而空载体呈现均匀分布,表明△PalCaLas基因跨膜区的存在影响该病菌在E.coli中的分布,推测该基因可能与黄龙病菌的某种生物学特性相关。