油菜素甾醇(brassinosteroids, BRs)是一类重要的植物生长调节剂,不仅调控了细胞伸长、分裂、维管束分化、种子萌发、生根、花粉管形成等一系列重要的植物生理学过程,还能提高植株对恶劣环境的抗逆性。然而,BRs的生理功能还未完全探明。分析方法研究可揭示植物组织中内源性BR的水平,有助于阐明其分子网络,对BRs的生理学研究具有重要意义。目前, HPLC-ESI-MS/MS已成为主流的分析平台,为BR的高效分离和高灵敏度的检测提供了强大的依托。尽管如此,BR分析仍受到内源性含量低、基质复杂、电喷雾质谱离子化效率低等因素的影响。另外,植物学家还对BRs分析提出了样品用量少、前处理简单快速的要求。这些问题促使分析化学家将研究重点放在样品前处理技术的方面,期望开发少量植物样品中快速、灵敏、高通量、高选择性的BRs分析方法。目前报道的方法虽然可以完成内源性BR的检测,但前处理技术的选择性、检测灵敏度、分析通量等方面仍有改进的空间。基于上述问题,本论文以建立快速、灵敏、高通量、高选择性的BRs分析方法为研究目标,针对BR分析领域存在的问题,将分析化学中的QuEChERS方法、硼亲和色谱、亲水作用色谱、富集衍生一体化这几种新原理与磁固相萃取(MSPE)、聚合物整体柱微萃取(PMME)、管内固相微萃取(In-tube SPME)、原位衍生(ISD)这几种新技术集成起来,发展内源性BRs的样品前处理技术,建立了多种新型BRs分析方法：一、为了去除植物组织中的干扰基质,利用改进的QuEChERS方法富集纯化提取液中的BRs,建立了植物组织中内源性油菜素甾醇的双层固相萃取-HPLC-MS/MS联用方法。石墨化炭黑/乙二胺-N-丙基键合硅胶双层SPE柱作为萃取介质有效吸附植物提取液中的色素和极性杂质,提高了BRs在实际样品中的检测灵敏度。该方法操作简单、快速,可在1gFW植物叶片或0.5g FW花中实现内源性BRs的准确定量。二、为了提高方法的选择性,采用具有硼亲和作用的聚(3-丙烯酰胺基苯硼酸-乙二醇二甲基丙烯酸酯)聚合物整体柱作为PMME的萃取介质选择性富集BRs,建立了多种植物组织中BRs的PMME-HPLC-MS/MS分析方法。与双层SPE法相比,硼亲和PMME法选择性更高,可有效去除植物提取液中的绝大部分杂质。三、为了改善前处理通量,我们采用“物理共混法”制备磁性QuEChERS吸附剂,引入“烯-巯基”点击化学合成硼亲和磁性纳米颗粒,利用所得的材料作为磁性吸附剂将MSPE引入BR样品前处理过程中,建立了连续MSPE-HPLC-MS/MS的内源性BR分析方法。该方法不仅保持了BRs富集的选择性,还显著加快了样品前处理速度,处理单个植物样品只需1小时。四、为了进一步提高BRs分析的灵敏度并实现自动化分析,采用Cl8PEEK管填充柱为富集柱,以4-N,N二甲氨基苯硼酸为衍生试剂,搭建了基于双泵-双六通阀的In-tube SPME-UPLC-MS/MS联用系统,成功实现了植物组织中内源性BRs的自动分析。通过程序控制,该系统可实现进样、萃取、衍生、分离、检测的自动化操作；在线富集的引入实现了样品溶液的大体积进样,原位衍生改善了油菜素甾醇电喷雾的离子化效率,使油菜素甾醇的质谱检测灵敏度提高近两个数量级,检出限达到pg/mL级,仅需300mg FW植物组织中即可对BRs准确定量。五、为实现少量植物组织中内源性BRs的快速、简单、高通量、高灵敏度分析这一终极目标,我们利用BRs的亲水性,引入表面极性的氧化钛沉积磁性中空介孔硅球(TiO2/MHMSS)同时作为磁性吸附剂和微反应器,开发了MSPE-原位衍生结合的新型前处理技术对植物提取液中的BRs先除杂富集后衍生,建立了新型的BRs分析方法。基于亲水作用的BRs萃取过程有效去除了植物提取液中的疏水杂质,降低了基质效应；原位衍生技术为BRs标记上易离子化的基团,质谱检测灵敏度提高一个数量级以上；MSPE模式使样品溶液与吸附剂的相分离简单、操作简便,其与原位反应结合的方式保证了萃取及衍生过程的快速发生,包括萃取、衍生、解吸的样品前处理过程10分钟之内即可完成。利用该方法可将植物用量进一步降低至100mg。