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翘嘴鳜(Siniperca chuatsi),属于鲈形目(Perciformes)、鳜亚科(Sinipercinae)、鳜属(Siniperca),是我国的名贵经济鱼类和重要淡水养殖品种。近年来随着我国翘嘴鳜养殖规模的不断扩大,种质退化和滥用鱼药等现象比较普遍,鳜鱼疾病日益猖獗,加大了养殖风险,每年都造成严重的经济损失。开发抗病遗传分子标记,选育抗病品系是解决翘嘴鳜病害发生的有效方法。为此,本实验首先采用比较转录组测序策略,分析和筛选出多种免疫相关通路和差异表达基因,以初步解析翘嘴鳜的抗病相关分子模式。然后选取TLR通路中的2个toll样受体基因(TLR3和TLR7)进行全长克隆,研究在Poly I:C、LPS刺激下TLR3-TRIF和TLR7-Myd88两个通路相关基因的表达模式,为深入挖掘其TLR通路相关分子标记及阐明该通路在抵御病原入侵过程中的分子应答模式提供基础数据。结果如下:1、构建了Poly I:C、LPS以及PBS刺激下的3个翘嘴鳜转录组文库,每个文库Clean Data均达到7.08 Gb,共得到Clean Data23.77 Gb,从头拼接组装得到209854条Transcript和87,628条Unigene,平均长度分别为1833.16 bp和944.25 bp,平均GC含量为48.72%,各样品Q30均不小于91%;两个差异表达集合共检测到DEG1140个,其中,LPS_PBS集共有差异表达基因896个,上调基因599个,下调基因297个;Poly I:C_PBS集共有DEG244个,上调基因97个,下调基因147个。KEGG分类和DEG富集分析显示:许多免疫相关通路(如JAK-STAT、TLR、NOD、RIG等)与其中显著富集到的差异表达基因(如EP300、IL-1β、IL-8、MAPK8、TNF-α3等)都参与到了翘嘴鳜抗病的免疫反应;q PCR验证结果与转录组测序中基因的趋势基本一致,说明了本次测序结果是可靠的,为后续研究翘嘴鳜免疫机制提供有了价值的线索。此外,还开发到翘嘴鳜的干扰素相关基因、炎症因子家族基因以及一些其他免疫调节因子,为开展翘嘴鳜应对不同病原刺激的免疫反应机制的研究奠定了分子基础。2、采用RACE技术克隆了翘嘴鳜TLR3、TLR7,生物信息学分析结果表明:两者的c DNA全长分别为3181 bp、3408 bp,各有一个ORF区,长度分别为2769bp、3156 bp,分别编码922、1051个氨基酸,均具备TLR受体家族成员典型的富含亮氨酸重复结构;氨基酸组成分析发现,TLR3编码的蛋白中疏水性氨基酸所占比例达到43.0%,亲水性氨基酸占51.4%;TLR7编码的蛋白疏水氨基酸占39.7%,亲水性氨基酸占55.8%。氨基酸同源性比对结果显示:TLR3、TLR7氨基酸序列与鲈形目鱼类亲缘关系最近;两个基因分别含有3个和1个内含子,TLR3外显子2和3以及TLR7外显子2与本实验中比对的多数鱼类长度基本一致。3、根据获得的翘嘴鳜TLR3和TLR7的c DNA全长设计特异性引物,检测这两个基因在不同组织中的分布,结果显示:TLR3在肝脏中表达水平最高,达到15.35;肠道次之,为8.85;其余组织中表达均很低;TLR7在脾和头肾中表达量最高,分别为94.02、87.93;肌肉次之,为29.41;在其他组织中均为微量表达,表明翘嘴鳜TLR3、TLR7基因为组织特异性表达。4、TLR7-Myd88通路相关基因的表达变化显示:Poly I:C刺激下,头肾中TLR7和Myd88在3 h分别出现显著上调,而IRAK1于48 h极显著上调(P<0.01);这三个基因在Poly I:C刺激下表达量的时间变化规律符合通路响应过程的先后顺序,极有可能与它们分别位于通路中上游和下游的地位有关;同时,脾脏组织中的Myd88于6 h极显著上调(P<0.01),表明翘嘴鳜Myd88参与了Poly I:C刺激下的免疫应答。IRF7和IFN-α3在Poly I:C刺激后脾脏中6 h均出现显著上调(P<0.05),但作为诱导干扰素分泌的IRF7表达量上调幅度较小,推测IFN-α3的上调还受到了TLR3-TAK1通路上其他主效基因的间接作用。在LPS刺激下,TLR7在脾脏中3 h时的表达量显著上调(P<0.05),于头肾12 h也被极显著诱导升高(P<0.01),说明翘嘴鳜TLR7能响应LPS的诱导。IRAK1基因在LPS刺激下脾脏3 h-48 h间表达量均显著上调(P<0.05),这可能是除TLR7之外,IRAK1同时还受到由其他TLRs通路传递来的信号作用所致。Myd88在LPS刺激后3 h和6 h在脾脏中均被显著诱导(P<0.05),推测翘嘴鳜Myd88能够响应LPS的影响。IRF7基因在LPS刺激后于脾脏中3 h出现上调,且IFN-α3也于24 h表达量显著上升(P<0.05),推测LPS激活了翘嘴鳜干扰素相关基因的表达,以促进机体分泌干扰素抑制抗原的增殖。TLR3-TRIF通路相关基因的表达变化显示:Poly I:C刺激下,翘嘴鳜TLR3于刺激后3 h时头肾中表达极显著上调(P﹤0.01),可能是由于TLR3作为病毒ds RNA的受体,受到了Poly I:C的诱导作出的快速响应;而TLR3在脾脏中表达量延迟至24 h才显著增加(P<0.01),可能是与具有中枢免疫器官及外周免疫器官双重功能的头肾相比,脾脏则主要具备外周免疫器官功能,因此在受到抗原刺激产生的应答反应较为滞后。头肾中,TLR3和TRAF6基因均在3 h极显著达到峰值(P﹤0.01),而TAK1则延迟至48 h才显著上调(P<0.01),这3个基因在Poly I:C刺激下表达量的时间变化规律符合该通路响应过程的先后顺序,与它们各自在通路中的上游和下游的地位相符合。在LPS刺激下,翘嘴鳜TLR3于脾脏中3 h表达量极显著低于对照组(P﹤0.01),说明TLR3可能不是LPS的识别受体。TAK1在Poly I:C刺激后的头肾中3 h表达量极显著上升(P﹤0.01),ikkβ也上调到对照组的9.51倍(P<0.05),且在头肾中IL-8和IFN-α3也3 h于出现显著上调,由此推测IL-8和IFN-α3的表达量上调可能是受到了TAK1和ikkβ的诱导。