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茶树(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)中含有丰富的酚类物质,统称为茶多酚,包括黄酚酸类、烷醇类、黄酮醇类、黄酮类、花青素类等。酚类物质是茶树的主要次生代谢产物之一,对决定茶叶品质及其健康功效具有重要作用。本文利用分离纯化鉴定及分子生物学等技术手段,对茶树PAs等酚类物质的纯化鉴定和组织器官特异性合成及积累进行了研究,主要研究结果如下。1.茶树酚类物质积累的组织器官特异性本文利用液相串联质谱技术(LC-TOF-MS、UPLC-QQQ-MS/MS),一次性定性了50种酚类物质,并且基于多重反应监测技术(MRM),对其中的29种酚类物质进行了定量分析。结果显示,大部分酚类物质积累在幼嫩的叶中,茎和根中积累相对较低,但是根中却大量积累了PAs。这一结果推进了人们对茶树根中多酚类物质积累的认识。运用实时荧光定量(qRT-PCR)和聚类分析的技术,对莽草酸途径、苯丙烷途径以及类黄酮途径的63个结构基因以及调节基因的表达模式进行了分析。根据表达模式的聚类分析结果,这些基因被分为两个主要的组,即C1和C2,其中C1组的基因主要是在根中高表达或者在芽和叶中低表达。而C2-2-1组和C2-2-2-1组基因主要与不同发育时期的叶中酚类物质的积累相关。酯化酶和水解酶的酶学分析则显示,儿茶素类的积累同时受合成与分解的影响。2.茶树不同组织器官原花青素PAs的分离纯化、鉴定及定量分析本文首先对茶树根中PAs的提取工艺进行了优化,筛选出最佳的提取工艺条件:提取溶液为80%丙酮加0.25%乙酸、提取时间为35 min、提取温度为50℃。再利用GF254硅胶板、硅胶柱纯化、制备型液相技术,对茶树根中聚合的PAs进行纯化,并用1H-NMR技术进行了分析,说明根中PAs的连接方式为C4-C6或C4-C8,组成单位是B环二羟基的、顺式的以及非没食子化简单儿茶素(EC)。茶树根中纯化的PAs,经正丁醇-HCl热解和分离纯化后,可以得到纯度大于98%的矢车菊色素单体。本文运用热解、硫解、NP-HPLC、HPLC-ESI-MS、MALDI-TOF-MS和13C-NMR技术,对茶树不同组织器官中原花青素进行定性分析。结果显示,在叶中,当PAs的聚合度较小时,B环二羟基和三羟基的结构单元同时存在,C2-cis形式的是主要的结构单元;当原花青素PAs聚合度大于5后,主要的聚合单位为EC;并且叶中包含有大量的单体儿茶素(EGCG、ECG、EGC和EC)。相比之下,在根中,儿茶素主要是以聚合的形式存在,尽管原花青素含量高且聚合度高,但是结构单元单一,EC是主要的结构单元。本文对茶树原花青素PAs的检测方法—香草醛法、对二甲氨基肉桂醛(DMACA)法进行了系统性的优化,结果表明香草醛法最优条件:反应温度0~25℃、反应时间15 min、硫酸体积分数为50%、香草醛浓度为10 g/L。对二甲氨基肉桂醛(DMACA)法最优条件:0℃、5 min内、盐酸浓度为1.2 mol/L、DMACA浓度为2 g/L。为了验证方法的灵敏度,本文分别以EC(单体)、B2(二聚的PAs)和纯化的根的PAs混合物(聚合的PAs)为标准品,采用各种化合物与试剂显色的标准曲线的斜率反映它们的显色灵敏度,结果显示用香草醛-H2SO4,DMACA-HCl和正丁醇-HCl热水解方法,得到显色的灵敏度差异很大。例如用纯化的根PAs作为标准品,分别用香草醛-H2SO4,DMACA-HCl和正丁醇-HCl方法,测得的根中PAs的含量分别为121.77mg/g,104.32 mg/g和85.06 mg/g。而通过分离纯化方法定量根中PAs含量为8.1%。纯化方法的定量结果与正丁醇-HCl实验的结果更接近。3.茶树PAs缩合机理的初步研究为了研究PAs聚合机理,本文探究了黄烷-3-醇的自动缩合反应机理。结果显示,以单体黄烷-3-醇为底物时,不管是在酸性还是碱性环境下,简单儿茶素都可以在室温条件下非酶性缩合形成不同的二聚体。但是,这些二聚体与茶树体内的并不相匹配,推测这些二聚体可能是茶树鲜叶中并不存在的体外氧化产物。当以原花青素B2与EC/C或者单独原花青素B2为底物时,在上述反应条件下,可以形成三聚体原花青素(m/z 865),且该三聚体可以在茶树体内被检测到。没有检测到酶学产物。由以上实验结果推测,在茶树原花青素PAs缩合机理中,原花青素B2不仅可以释放亲电的上端碳正离子单位,还可以作为亲核的下端单位,两者自动缩合形成原花青素三聚体。