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登革热(Dengue fever,DF)是由登革病毒(Dengue virus,DENV)感染所引起的一种虫媒传染性疾病,轻者主要引起无症状感染或者产生轻微的症状,严重者可导致发生登革出血热(Dengue hemorrhagic fever,DHF)和登革休克综合征(Dengue shock syndrome,DSS)。WHO2014年2月发布的报告称登革热为全球蔓延最快的病媒传播疾病,发病数量在过去50年间增加了约30倍。已构成美洲、东南亚、西太平洋地区的严重的健康问题和经济负担。2014年,登革热在我国南方(主要是广东省)再次发生大流行,仅广东省累积报告登革热病例超过45000例,再次敲响了防治登革热的警钟。在目前尚无登革特异性治疗药物批准的情况下,登革疫苗的研发愈发重要。目前有数个登革疫苗正在进行临床试验,仅有一种疫苗通过Ⅲ期临床试验,但此疫苗对不同血清型登革病毒保护性差异较大,尤其对2型登革病毒几乎无保护作用。鉴于登革病毒多种血清型及其致病机制的复杂性,尤其二次感染异型登革病毒所产生的抗体增强作用(ADE)更是成为疫苗研发的重要掣肘。登革病毒属于黄病毒家族,为有包膜的单正链RNA病毒,包括四种不同的血清型,基因组长度约llkb,编码三种结构蛋白(C,衣壳蛋白；M,膜蛋白；E,包膜蛋白)及7种非结构蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5)。其中,由于E蛋白暴露在病毒表面,是诱导登革病毒中和抗体产生的主要蛋白,也是与疫苗研究相关的主要蛋白；非结构蛋白参与登革病毒生活周期的重要环节,相关研究主要用于体外诊断试剂的研发上。E蛋白含有3个功能区,I区(EDI)位于中心；Ⅱ区(EDⅡ)位于侧面,含融合环；Ⅲ区(EDⅢ)呈免疫球蛋白样折叠,被认为能够与细胞表面受体结合及中和抗体的主要靶点,登革热疫苗研究的靶标也多集中于EDⅢ蛋白。研究表明,从感染登革病毒患者体内分离的登革病毒抗体中含有交叉反应性及型特异性EDⅢ抗体,且抗登革病毒诸多成分的抗体中,EDⅢ抗体在Vero细胞感染模型中具有最强的中和活性。重组EDⅢ蛋白鼠源单抗亦具有体内外中和作用。已经证实去除登革病毒感染患者恢复期血清中EDⅢ抗体并不改变该血清的中和作用及ADE作用,可能原因为患者血清中抗EDⅢ抗体含量低,在整个血清保护作用中占的比例较低。但是如能够促进患者体内EDⅢ抗体的产生并达到有效浓度,EDⅢ抗体很可能具有强大的中和保护作用,因而具备作为治疗性抗体的潜能。而患者体内EDⅢ抗体产生较少的直接原因可能是作为登革病毒多种抗原成份之一的EDⅢ蛋白在自然感染的抗原竞争中处于劣势,从而不能诱导有效的抗体反应。因此解析EDⅢ蛋白中和表位,进而制备亚单位疫苗避免多种成份的抗原竞争仍是重要的疫苗研发策略,亦是本研究的切入点。在本实验室前期工作中,用DENV1-4 EDⅢ重组蛋白免疫小鼠制备了一批EDⅢ蛋白鼠源性单克隆抗体,并用免疫学方法对其进行了鉴定。本研究的思路是,在与四种血清型EDⅢ蛋白均发生交叉反应的单抗中,以体外微中和实验方法(Enzyme-linked immune spot-based micro-neutralization test, ELISPOT-MNT),鉴定出2株单抗对不同血清型登革病毒具有较好的体外中和作用,单抗克隆号为2811A35和2D73A7,再从噬菌体展示肽库中筛选其可能的抗原结合表位,寻找具有四型登革病毒交叉保护性抗体结合EDⅢ蛋白的表位特征,并为进一步探索其结构与功能之间的关系提供参考。一、登革病毒EDⅢ蛋白单克隆抗体交叉中和活性的鉴定由于登革病毒多种血清型及致病机制的复杂性,理想的疫苗应诱导出针对四种登革血清型的交叉中和抗体,理想的靶点为存在于4种血清型病毒的保守表位,因此本部分内容旨在寻找对四种血清型登革病毒具交叉保护作用的单抗。我们从实验室前期制备的27株能与四种血清型登革病毒EDⅢ蛋白反应的交叉反应性单抗中,运用ELISPOT-MNT微中和实验方法,鉴定出2株对不同血清型登革病毒具有较好保护作用的单抗。本章工作将单抗分别与四种血清型登革病毒孵育后感染LLC-MK2细胞,通过斑点显色的方法,检测并计数被感染细胞的数量。结果显示单抗与病毒孵育后能明显降低病毒对细胞的感染,随着单抗浓度的增加,被感染的细胞数明显减少,直到能完全保护细胞不被感染。其中,单抗2B11A35对1、2、3型登革病毒有较好的中和活性,50%抑制浓度(IC50)均小于1.5μg/ml,但是对4型登革病毒中和活性较差,IC50>80μg/ml;单抗2D73A7对2、3型登革病毒有较好的中和活性,IC50<3.5μg/ml,对4型登革病毒中和活性次之,IC50<8μg/ml,对1型登革病毒的中和活性最差,IC50>200μg/ml。本部分内容鉴定出两株具有交叉保护作用的单克隆抗体,这两株单抗对不同血清型登革病毒具有明确的中和作用。理论上,具有交叉中和作用的单抗结合的应该是存在于不同血清型登革病毒EDⅢ蛋白上的保守表位,交叉中和单抗结合EDⅢ蛋白表位特征值得进一步研究。二、单抗2B11A35和2D73A7结合表位的筛选与鉴定用交叉中和单抗2B11A35和2D73A7分别从噬菌体随机展示线性12肽库(linear dodecapeptide phage display libraries,Ph.D.-12)和噬菌体随机展示环状7肽库(loop-constrained heptapeptide phage display libraries, Ph.D.-C7C)中筛选与单抗特异性结合的噬菌体克隆。用单抗2B11A35对线性肽库(Ph.D.-12)进行了3轮淘选,噬菌体滴度富集了7500倍,从第三轮洗脱产物中挑选了20个噬菌体克隆；用单抗2B11A35对环7肽库(Ph.D.-C7C)进行了3轮淘选,噬菌体滴度富集了673倍,从第三轮洗脱产物中挑选了20个噬菌体克隆；用单抗2D73A7对Ph.D.-12对进行了3轮淘选,噬菌体滴度富集了5396倍,从第三轮洗脱产物中挑选了30个噬菌体克隆；用单抗2D73A7对Ph.D.-C7C进行了4轮淘选,噬菌体滴度富集了5111倍,从第四轮洗脱产物中挑选了20个噬菌体克隆。采用结合ELISA鉴定单抗与噬菌体克隆结合情况,结果获得17个与单抗2B11A35特异性结合的Ph.D.-12克隆,20个Ph.D.-C7C克隆；26个结合单抗2D73A7的Ph.D.-12克隆和18个Ph.D.-C7C克隆。所有阳性克隆均排除了吸板序列的可能性,且与无关单抗不结合。对所获阳性克隆分别进行扩增、DNA提取并全部送上海生工生物工程有限公司进行测序。单抗2B11A35筛选的17个Ph.D.-12克隆中重复性最高的序列分别为THNGPGRFTGIL、THYCAWDQKNCL和THQPQPKIPAVT;20个Ph.D.-C7C克隆中重复性最高的序列WHGHPHH和GHDLHPA。单抗2D73A7筛选到的26个Ph.D.-12克隆中重复性最高的序列分别为LHRYSPDGASYA和LHRYDVSNNLPN;18个Ph.D.-C7C克隆中重复性最高的序列PMYGWDM和WAYGFNM。表位预测结果表明两株单抗结合EDIII蛋白构象表位,且两株单抗结合表位在EDIII蛋白上有重叠,但跨度不同。结合前期ELISA鉴定结果及测序分析,将单抗2B11A35筛选的Ph.D.-12中含重复性较高,且ELISA结果显示结合特异性较好的序列进行化学合成。最终选出4个线性12肽序列,分别为No.1 HSTHNGPGRFTGILGG,No.9 HSYSLEPTHRNHNHGG, No.11 HSHDARYHLHLKPTGG, No.14 HSTHQPQPKIPAVTGG.因合成肽的N端偶联有生物素,合成肽抗原性的鉴定采用了四种不同ELISA实验方案,结果四种实验方案均无法检测到单抗与合成肽的结合,且将合成肽与卵清白蛋白(ovalbumin, OVA)偶联后与单抗亦不结合。究其原因主要是构象性表位短肽难以通过合成表达可展示在噬菌体表面上的抗原性。三、噬菌体免疫小鼠评价筛选模拟肽的免疫原性将单抗2B11A35筛选Ph.D.-12得到的1、9、11、14号噬菌体克隆进行扩增并纯化,以1012pfu/ml与弗氏佐剂乳化后免疫免疫BALB/C小鼠,同时用空载体噬菌体免疫作为对照。三轮免疫后,收获的小鼠抗血清可与噬菌体结合,血清效价约为800,同时免疫小鼠血清也能与1、3、4型DENV EDⅢ蛋白及2型登革病毒感染Vero细胞特异性结合。 结果表明所筛选的噬菌体展示肽能够模拟DENV EDⅢ蛋白上单抗2B11A35识别的表位,能够诱导产生针对4种血清型登革病毒的交叉抗体反应,提示上述序列模拟了存在于不同血清型登革病毒EDⅢ蛋白的保守表位,且均为构象性表位。