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目前全世界大约有9%的夫妇,约8000万人患有不孕症。自1978年人类首个试管婴儿路易丝·布朗诞生以来,辅助生殖技术（assisted reproductive technology,ART）已经成为治疗不孕症的主要手段,尤其在近10年得到了充分的发展和应用。ART助孕分娩的婴儿数量在世界范围内稳步增长,最新的数据统计显示,通过ART出生的婴儿数量已经超过1000万。控制性促排卵（controlled ovarian hyperstimulation,COH）是辅助生殖治疗中的关键技术之一,即利用药物刺激卵巢内多个卵泡同步发育,以获得多个成熟卵母细胞的技术。COH治疗时,由于多个卵泡同步发育,卵巢产生的雌激素水平高达生理水平的10-20倍,使排卵期及妊娠早期的母体暴露于高水平的雌激素环境。COH高雌激素环境致胚胎植入率显著降低,临床妊娠率显著降低,随着雌激素水平的升高,胚胎植入率、临床妊娠率逐渐下降,且低出生体重的发生风险逐渐升高。这些发现表明,辅助生殖技术助孕中,COH高雌激素环境是导致不良妊娠结局的重要危险因素。揭示COH高雌激素环境致不良妊娠结局发生风险升高的原因,并阐明其发生机制,是辅助生殖医学领域亟待解决的重要科学问题之一。本研究中,本课题组以自然发情的假孕母鼠作为对照组,COH处理的假孕母鼠作为实验组,将未受干扰、体内发育至囊胚的胚胎移入假孕鼠子宫内,以排除COH对卵子和植入前胚胎的影响,单独分析COH高雌激素环境通过影响子宫内膜微环境对胎盘结构和功能的影响。进一步通过建立体内和体外高雌激素模型,明确和验证引起胎盘结构和功能异常的可能机制,从而为COH高雌激素环境导致不良妊娠结局发生风险增高提供新的分子机制。第一部分COH高雌激素环境对胎鼠和胎盘的影响目的:探究COH对胎鼠和胎盘的影响,明确COH高雌激素环境是否是导致胎鼠和胎盘异常的重要原因。方法:选择性成熟雌性小鼠腹腔注射PMSG 5IU/只,48h后腹腔注射h CG 5IU/只,作为超促排卵交配假孕组（COH组）,选择自然发情雌鼠作为自然交配假孕组（NC组）,两组雌鼠与输精管结扎雄鼠1:1合笼,见栓当天记为假孕0.5天。选择性成熟、自然发情的雌性小鼠与正常雄鼠1:1合笼,见栓者标记为供胚雌鼠妊娠0.5天,于妊娠3.5天显微镜下冲出囊胚以备移植使用。将上述囊胚移植入假孕母鼠假孕3.5天的子宫中,每侧子宫角各移植8枚。移植后于妊娠18.5天解剖子宫,取胎鼠和胎盘称重记录,每只假孕母鼠固定1个胎盘,剩余胎盘组织液氮速冻,-80℃冰箱冻存。高雌激素模型选择性成熟自然发情雌性小鼠与正常雄鼠1:1合笼,见栓者标记为妊娠0.5天,EV100组即高雌激素组于妊娠5.5-12.5天给予口服溶于玉米油的17β-雌二醇（100μg/kg/d）,Oil组即对照组给予相同体积玉米油。于小鼠妊娠14.5天对胎鼠和胎盘进行称重记录。通过计算胎盘效率（胎鼠重量/胎盘重量）表示胎盘功能;采用PAS染色和HE染色分析胎盘结构（以胎盘迷路区面积占胎盘总面积的百分比表示）。结果:①在COH模型中,与NC组相比,COH组小鼠妊娠18.5天胎鼠重量（1523.74±52.23 mg vs.1207.84±136.15 mg,P＜0.001）降低,差异有统计学意义。胎盘重量（107.62±3.33 mg vs.101.63±8.71 mg,P＞0.05）差异无统计学差异。与NC组相比,COH组小鼠胎盘效率（14.17±0.54%vs.12.03±2.12%,P＜0.01）降低,差异有统计学意义。在高雌激素模型中,与Oil组相比,EV100组小鼠妊娠14.5天胎鼠重量（310.30±17.14 mg vs.257.82±19.64 mg,P＜0.001）降低,差异有统计学意义。与对照组相比,EV100组小鼠胎盘重量（97.33±3.09mg vs.89.79±6.27mg,P＜0.05）降低,差异有统计学意义。与对照组组相比,EV100组小鼠胎盘效率（3.19±0.24%vs.2.88±0.23%,P＜0.05）降低,差异有统计学意义。② PAS染色结果显示,在COH模型中,与NC组相比,COH组小鼠胎盘迷路区面积占胎盘总面积的百分比降低,差异有统计学意义（P＜0.01）。在高雌激素模型中,与对照组相比,EV100组小鼠胎盘迷路区面积占胎盘总面积的百分比降低,差异有统计学意义（P＜0.05）。HE染色结果显示,在COH模型中,与NC组相比,COH组小鼠胎盘迷路区面积占总面积的比值有降低趋势,差异无统计学意义（P=0.057）。在高雌激素模型中,与Oil组相比,EV100组小鼠胎盘迷路区面积占胎盘总面积的百分比降低,差异有统计学意义（P＜0.01）结论:COH高雌激素环境影响了小鼠胎盘迷路区的面积占比,致胎盘效率降低,胎盘结构发生改变,这可能是COH导致胎鼠体重降低的重要原因。第二部分COH高雌激素环境对小鼠子宫trNK细胞募集和分化的影响目的:妊娠后母胎界面子宫组织驻留NK（tissue-resident NK,trNK）细胞的数量迅速增加,且子宫trNK细胞的细胞毒性较弱,具有较强的促炎症因子、血管生成因子和生长促进因子分泌功能,在调控胎盘的发育和功能发挥中具有重要作用。因此,该部分实验主要探究COH高雌激素环境是否会影响子宫trNK细胞的募集和分化,并通过检测COH对蜕膜组织趋化因子和细胞因子表达的影响,初步揭示COH致子宫trNK细胞募集和分化异常的机制。方法:NC组和COH组小鼠模型的构建方法同第一部分实验,分别于妊娠6.5天,9.5天和12.5天收取小鼠蜕膜样本。EV100组即高雌激素组和Oil组即对照组小鼠模型构建方法同第一部分实验,并于妊娠9.5天获取蜕膜组织。采用免疫组织化学技术和PAS染色对小鼠蜕膜组织中的子宫trNK细胞密度进行分析（以阳性细胞细胞数占总细胞数的百分比表示）;采用q RT-PCR技术检测趋化因子CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL14、CX3CL1、CCL2,细胞因子IL-15、IL-24、PLGF、TGF-β的m RNA表达水平;分离纯化小鼠子宫内膜基质细胞（endometrial stromal cells,ESCs）,体外诱导蜕膜化同时给予不同浓度雌激素刺激,采用q RT-PCR技术比较不同浓度雌激素对蜕膜化的ESCs即蜕膜基质细胞（decidual stromal cells,DSCs）上述细胞因子的表达水平的影响。结果:①在COH模型中,与NC组相比,COH组小鼠妊娠6.5天,9.5天和12.5天的子宫trNK细胞密度和成熟度降低,差异有统计学意义（P＜0.001）。在高雌激素模型中,与对照组相比,EV100组小鼠妊娠9.5天的子宫trNK细胞密度和成熟度降低,差异有统计学意义（P＜0.001）。②与NC组相比,COH组小鼠蜕膜中趋化因子CXCL10、CXCL11、CXCL12、CX3CL1及CCL2表达水平降低,差异有统计学意义（P＜0.05）。与NC组相比,COH组小鼠蜕膜中细胞因子IL-15、IL-24、PLGF、TGF-β的表达水平降低,差异有统计学意义（P＜0.05）。③与NC组相比,雌激素处理组的DSCs分泌趋化因子CXCL12、CXCL14、CX3CL1的m RNA表达水平降低,差异有统计学意义（P＜0.05）。与NC组相比,雌激素处理组的DSCs分泌细胞因子IL-15、PLGF、TGF-β的能力降低,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论:COH高雌激素环境通过降低对子宫trNK细胞募集和分化发育至关重要的趋化因子和细胞因子的表达,从而影响妊娠早期子宫trNK细胞的募集和分化发育,这可能是COH高雌激素环境致胎盘异常的重要分子机制。第三部分COH高雌激素环境导致子宫trNK细胞异常的可能分子机制目的:明确NF-κB对子宫trNK细胞募集和分化的调控作用,明确COH高雌激素环境是否通过抑制NF-κB信号通路,影响下游趋化因子、细胞因子的表达致子宫trNK细胞募集和分化异常。方法:收取COH模型小鼠妊娠8.5天蜕膜组织（步骤同前）,采用Western Blot技术检测NF-κB活性;挑选性成熟自然发情雌性小鼠,与正常雄鼠1:1合笼,于妊娠5.5-7.5天给予小鼠腹腔注射NF-κB抑制剂（250mg/kg）,于妊娠8.5天收取孕囊组织固定于4%多聚甲醛中（方法同前）,其余孕囊称重记录后剔除胎鼠和胎盘收集蜕膜组织,液氮速冻后冻存于-80℃备用;于妊娠14.5天分离胎鼠和胎盘,称重记录并计算胎盘效率（胎鼠重量/胎盘重量）;采用免疫组织化学技术和PAS染色对小鼠子宫trNK细胞密度（以阳性细胞数占总细胞数的百分比表示）进行分析;采用q RTPCR技术检测小鼠蜕膜组织趋化因子、细胞因子的m RNA表达水平。结果:①与NC组相比,COH组小鼠蜕膜NF-κB活性降低,差异有统计学意义（P＜0.05）。②给予NF-κB抑制剂后,妊娠8.5天孕囊重量（29.54±4.38 mg vs.22.13±1.61 mg,P＜0.001）降低,差异有统计学意义;妊娠14.5天胎鼠重量（272.83±10.03 mg vs.223.47±10.03 mg,P＜0.001）、胎盘重量（100.10±5.57 mg vs.94.07±1.97 mg,P＜0.05）降低,差异有统计学意义;胎盘效率（2.73±0.19%vs.2.37±0.08%,P＜0.01）降低,差异有统计学意义。③给予NF-κB抑制剂后,子宫trNK细胞密度降低（P＜0.001）,差异有统计学意义。④给予NF-κB抑制剂后,蜕膜组织中趋化因子CXCL11、CXCL12、CXCL14、CX3CL1、CCL2的m RNA表达水平降低,差异有统计学意义（P＜0.05）,细胞因子IL-15、IL-24、PLGF、TGF-β的m RNA表达水平降低,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论:COH高雌激素环境可能通过抑制NF-κB活性,影响其下游调控子宫trNK细胞募集和分化的关键趋化因子和细胞因子的表达,进而影响了子宫trNK细胞的募集和分化导致胎盘异常,最终影响子代的生长发育。