慢性心衰是当今世界上最严重的疾病之一,作为临床多种心血管疾病的终末期表现,因其死亡率高,治疗棘手,而成为现代临床医学重点研究的难题。对心衰的防治一直是心血管领域中基础医学与临床医学研究的主要课题之一。20世纪90年代以后,逐渐明确了以神经内分泌-细胞因子激活,尤其是肾素-血管紧张素系统的激活所导致的心室重构是心衰发生发展的基本机制。正常心脏组织主要由心肌细胞、心肌成纤维细胞等实质细胞和Ⅰ、Ⅲ型胶原等间质成分组成。间质成分中,Ⅰ胶原占80%,Ⅲ型胶原占15%。心肌损伤时,心肌细胞肥大、凋亡,代之以心肌成纤维细胞大量增殖,Ⅰ型胶原分泌增加,Ⅰ/Ⅲ型胶原比例失调是心衰心室重构的结构基础。Ⅰ胶原是细胞外间质的主要成分,在心肌中主要由心肌成纤维细胞合成和分泌。Ⅰ胶原分子由三条肽链组成,两条α1(Ⅰ)链和一条α2(Ⅰ)链,这两种肽链由各自不同的基因编码,且严格按2:1的比例合成。三条肽链相互缠绕形成胶原蛋白分子特有的三螺旋杆状结构。因此,我们可以α1(Ⅰ)链为代表来研究Ⅰ型胶原的情况。AngⅡ是肾素-血管紧张素系统(RAS)的主要代表之一,在心衰心室重构中起着重要作用。国内外研究均已证实,AngⅡ在体和离体都可引起心肌成纤维细胞增殖,促进其分泌Ⅰ型胶原,明显增强Ⅰ型胶原mRNA的表达。但对Ⅰ型胶原基因在表达之前被AngⅡ激活的机制研究,尤其是在心肌成纤维细胞中的机制研究,国内则尚无报道。在基因被激活之前,启动子的激活是关键。所以,研究AngⅡ是如何激活Ⅰ型胶原基因的表达,就是研究AngⅡ对Ⅰ型胶原启动子活性的调控作用。中医学虽有“心衰”的病名,但与现代医学意义上的心衰并不完全一致。有关心衰的论述散见于“心痹”、“心悸”、“怔忡”、“喘证”、“水肿”、“心水”等范畴。经过长期的临床实践,中医药在防治心衰方面取得了一定的进展。对心衰病因病机的认识,目前已基本趋于一致,认为主要与心气(阳)虚、血瘀和水停有关。在治疗上多采用益气活血,温阳利水之法。其中,对益气活血中药黄芪、丹参和川芎嗪等的研究表明,它们具有明确的改善心衰心室重构的作用。本课题利用基因重组、细胞基因转染、报告基因测活等技术,进行AngⅡ调控心肌成纤维细胞转染的Ⅰ型胶原启动子活性作用的研究,并在此基础上,观察具有改善心功能的益气活血中药成分黄芪甲苷、丹参酮ⅡA和川芎嗪,对心肌成纤维细胞增殖、Ⅰ型胶原含量和mRNA表达的影响及对Ⅰ型胶原启动子的调控作用。希望能从细胞水平、基因转录水平认识心室重构的病理机制,并为中医药延缓或阻滞心室重构,防治心衰提供实验依据。本论文实验共分为七个部分,具体实验方法及结果如下:益气活血中药对心衰心室重构I型胶原启动子活性调控的研究 1.心肌成纤维细胞的培养鉴定及劫911对其增殖的影响 利用心肌细胞、成纤维细胞贴壁时间不同,采用反复差速贴壁的方法,提取原代心肌成纤维细胞,经形态学观察和波形蛋白免疫组化染色,鉴定为心脏成纤维细胞 (eFB)。在此基础上,采用MTT法观察了10一,、10一s、10一gmoFI的劫9 11对eFB增殖的影响。结果显示,Ang 11 10--,可明显促进CFB增殖。 2.丹参酮nA、川芍嗦、黄茂甲昔对CFB增殖的影响 采用MTT法观察了丹参酮IIA、川芍嗦、黄茂甲营三个中药单体对CFB增殖的影响,结果显示,三个中药单体均可直接抑制CFB的增殖。 3.丹参酮IIA、川芍嗦、黄茂甲普对Angn诱导的CFB增殖的影响 取劫911 10一7m0班为模型组,观察丹参酮nA、川芍嗦、黄茂甲营对Angn诱导的eFB增殖的影响,结果显示,丹参酮11^1 00、50林留ml,川芍嗦500卜创ml,黄茂甲昔100、50林留ml均可抑制由劫911诱导的CFB增殖。 4.丹参酮IIA、川芍嗦、黄茂甲昔对Angn诱导的I型胶原含量增加的影响 根据实验一和实验三的结果,取丹参酮n^l 00u创ml、川芍嗦800ug/ml、黄茂甲昔100ug/1lll与Angn10一7mo讥共同作用,采用EusA法观察三个中药单体对Angn诱导的I型胶原含量的影响,并选用Losartanlo一6m0功作阳性对照。结果显示,Losartanzo-6mo功、丹参酮IzAlooug/ml、川芍嗦soou咖z对劫911引起的I型胶原分泌增加有抑制作用,而黄茂甲昔loou留ml对Angn引起I型胶原分泌增加未见抑制作用。 5.丹参酮nA、川芍嗦、黄茂甲昔对Angn诱导的I型胶原mRNA表达的影响 采用二步法RT一PCR观察丹参酮llA、力l芍嗦、黄茂甲普对Angn诱导的I型胶原mRNA表达的影响,结果显示,Losartanlo一阮。班、丹参酮n Aloou创ml、川芍嗦sooug/ml可抑制AngH诱导的I型胶原mRNA表达增强,黄茂甲昔looug/ml未见明显作用。 6.pCoLH质粒重组体的构建及活性测定 为寻找调控人al(I)基因高启动活性片段,对人al(I)胶原基因上游5’侧翼区一2.skb一+42bp的片段进行5’系列缺失,与含报告基因cAT但不含启动子的载体组成重组体,重组体采用脂质体法转染至培养的人皮肤成纤维细胞后,以ELISA法测定CAT活性。结果显示,人CoLIAI基因上游一2483~+42bP、一268~十42bP序列具有较强启动表达活性,其余4个片段的启动活性自强至弱依次为一1448~+42bP、一829~+42饰、一496一+42bP、一105一+42bP。 7.丹参酮llA、?