【背景】胃癌相关基因GCRG213是我们实验室筛选出的一条在肠型胃癌组织、癌旁和正常组织间差异表达的新基因,初步研究表明:该基因与人体内无嘌呤无嘧啶核酸内切酶(apurinic/apyrimidinic endonuclase,APE/Ref-1)序列有61%同源性并且含有其保守的功能位点;用其正、反义克隆及小干扰RNA片段转染人胃癌细胞系MKN45细胞后,能分别增加和减弱细胞的生长速度和成瘤性。本实验在此基础上对GCRG213进行进一步研究,同时为胃癌的基因治疗提供实验基础和理论依据。利用本实验室构建好的一套胃癌组织芯片,我们还对胃黏膜组织中APE的表达进行了初步分析。 随着生物技术的发展,腺相关病毒(AAV)载体成为目前载体工具研究的热点,同逆转录病毒载体和腺病毒载体比较,它具有无致病性、无免疫原性、能感染分裂期和非分裂期细胞、能稳定整合到宿主细胞内长期表达等优点,有望成为人体基因治疗和基因功能研究最理想的载体工具。 【目的】1.观察GCRG213正、反义克隆和shRNA干扰片段体内转染对裸鼠胃癌种植瘤生长的影响,分析GCRG213功能;2.比较GCRG213和APE蛋白表达水平,分析两者是否相关;3.研究APE在胃癌组织的表达状况及与临床病理因素和胃癌患者预后的关系。 【方法】1.用pAAV Helper-free system包装含GCRG213正、反向DNA片段的腺相关病毒:设计针对GCRG213有效读框(ORF)的特异性引物,并根据病毒包装载体上特异性酶切位点,在引物两端分别引入相应内切酶识别位点,从pGEM-T质粒上扩增出GCRG213的DNA片段,按正、反向克隆入包装载体上,检测无误后,同pHelper质粒、pRC质粒一起用磷酸钙转染法转染HEK293细胞,分别包装出含GCRG213正、反向DNA片段的腺相关病毒。 2.包装含shRNA干扰片段的腺相关病毒:从含干扰效率相对较高RNAi片段的IMG-800质粒上选择特异性酶切位点,连同U6启动子一起切下RNAi片段,插入病毒包装载体,包装出含U6启动子和RNAi片段的腺相关病毒。