【摘 要】
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防御素是抗菌肽（Antimicrobial peptides,AMPs）中的最大家族成员之一,被认为是构成原始有效宿主防御系统的一部分。防御素在自然界中广泛存在,脊椎动物、无脊椎动物乃至植物和真菌中均有产生,通常为具有2-4对二硫键的阳离子短肽,大小在34-54个氨基酸残基之间。牡蛎生活在海洋的潮间带或潮下带,频繁接触来源于海洋的丰富病原体。蚊生于污水中,喜潮湿而阴暗的环境,自身携带多种蚊媒病毒、
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防御素是抗菌肽（Antimicrobial peptides,AMPs）中的最大家族成员之一,被认为是构成原始有效宿主防御系统的一部分。防御素在自然界中广泛存在,脊椎动物、无脊椎动物乃至植物和真菌中均有产生,通常为具有2-4对二硫键的阳离子短肽,大小在34-54个氨基酸残基之间。牡蛎生活在海洋的潮间带或潮下带,频繁接触来源于海洋的丰富病原体。蚊生于污水中,喜潮湿而阴暗的环境,自身携带多种蚊媒病毒、疟原虫、丝虫等病原体。面对无处不在的病原微生物侵袭,牡蛎和蚊作为无脊椎动物虽不具备完善的特异性免疫应答,但它们的先天免疫能力却是惊人的。防御素作为先天性免疫应答的效应物,具有广谱抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗疟原虫等多种生物学活性,为牡蛎和蚊抵抗外来病原微生物的入侵提供可能。蚊作为一种节肢动物门昆虫纲动物,具有众多的独特生物学特征。如蚊携带多种蚊媒病毒（寨卡病毒、登革热病毒、乙型脑炎病毒）、疟原虫、丝虫等病原体,通过叮咬传播这些病原体,并导致相关疾病的广泛流行。蚊的另一特征是叮咬人类或其他哺乳动物时会产生显著的瘙痒病理现象。众所周知,蚊叮咬时唾液腺分泌的成分中不仅含有病原体,而且富含多肽组份,防御素就是其中一类重要的多肽组份。但不知道蚊唾液腺分泌的防御素与病毒传播是否有关以及能否引起瘙痒。首先,本研究从太平洋牡蛎中鉴定了三个防御素。通过生物信息学方法,从太平洋牡蛎（Magallana gigas）基因组中搜索比对防御素基因开始,通过查阅文献找到23个含有四对二硫键的牡蛎防御素,在NCBI网站下载它们的CDS序列和太平洋牡蛎全基因组,通过与全基因组的本地Blast比对后获得三个太平洋牡蛎特有的防御素序列Mgdef-1、Mgdef-2和Mgdef-3。运用分子生物学技术,从太平洋牡蛎组织中成功克隆并测得它们的基因序列和c DNA序列,并对其进行序列和结构上的生物学分析,在基因水平及转录水平上证实了三个防御素在太平洋牡蛎中真实存在。其次,本研究制备了牡蛎防御素rMgdef-1、按蚊防御素Asdef-1和Agdef-2。利用原核表达,镍柱纯化,酶切去除标签蛋白及RP-HPLC分离纯化得到重组太平洋牡蛎防御素rMgdef-1,该肽具有40个氨基酸残基和4对二硫键,经质谱鉴定其分子量为4291.35 Da,与理论分子量相符合。通过化学合成获得斯氏按蚊防御素和冈比亚按蚊防御素还原型线性多肽,溶解后于Tris-HCl缓冲体系进行氧化重折叠,使其形成3对分子内二硫键,通过RP-HPLC反向分离半制备柱将氧化型多肽分离纯化,经质谱鉴定其分子量分别为4194.10 Da和4682.37 Da,成功制备了氧化型多肽（Ox-Asdef-1和Ox-Agdef-2）。最后,本研究对三种防御素rMgdef-1、Ox-Asdef-1和Ox-Agdef-2的功能进行了初步探究。采用抑菌圈和最小抑菌浓度实验测定了它们对两种革兰氏阳性菌和两种革兰氏阴性菌的抗菌活性,结果表明rMgdef-1和Ox-Asdef-1对革兰氏阳性菌S.aureus AB94004具有良好的抑菌活性,Ox-Asdef-1还对阴性菌E.coli ATCC25922具有较好的抗菌活性,而Ox-Agdef-2对以上标准菌株未能表现出抗菌活性。由于蚊叮咬传播寨卡病毒,通过病毒感染细胞实验检测了两种按蚊防御素Ox-Asdef-1和Ox-Agdef-2在RNA和蛋白水平对寨卡病毒的影响,结果显示两条按蚊防御素不具备抗寨卡病毒作用,这不同于众多防御素有抗病毒功能的属性。鉴于蚊叮咬大多会诱导机体产生瘙痒感觉,我们利用小鼠瘙痒模型并结合Ca2+荧光显微成像技术发现Ox-Asdef-1和Ox-Agdef-2均能诱导小鼠产生抓挠行为,且发现了其通过激活外周神经系统的Mrgpr C11/Mrgpr X1-TRPV1信号轴引起瘙痒的分子机制。综上所述,本研究从太平洋牡蛎中鉴定了三种防御素,并发现其中一种防御素具有抗菌活性,丰富了对海洋动物抗微生物肽的了解;制备了氧化型按蚊防御素Ox-Asdef-1与Ox-Agdef-2,发现其不同于众多防御素的抗病毒属性,不具备抗寨卡病毒作用,但可能与蚊子叮咬传播病毒的现象正相关;鉴定了两种按蚊防御素Ox-Asdef-1与Ox-Agdef-2诱导产生痒觉及其初步分子机制,部分解释了蚊叮咬产生瘙痒的病理现象,为预防和治疗蚊叮咬产生瘙痒提供新策略。
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