膀胱癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤，其发病率占成人恶性肿瘤的8％。近年来全球膀胱癌的发病率在增加，在欧洲居常见肿瘤的第五位，在美国居第四位。在我国膀胱癌是最常见的泌尿系恶性肿瘤，发病率高，位居全身肿瘤的第八位，近年来，我国部分城市肿瘤发病率报告显示膀胱癌发病率有增高趋势。 膀胱癌的发生是一个多步骤，多阶段，多基因的复杂生物学过程，膀胱癌发生发展的一重要机制是抑癌基因的突变、失活或丢失。在复制及转录过程中因抑癌基因的突变或缺失不能修复受损的DNA，失去对信号通路的活性下调作用及抑制细胞增殖的功能，使携带有异常DNA的细胞无限制地复制、增殖，最终导致肿瘤的发生。 人类RUNX3基因属于抑癌基因，位于染色体1p36.1。编码产物runx3蛋白是由α、β亚单位组成的异源二聚体，在转录调节中起重要作用。 国内有关RUNX3基因的研究刚刚起步，为数不多的几项研究也集中在胃癌和肝细胞癌中，国外有关RUNX3基因的研究主要集中于消化道肿瘤，在膀胱癌中的研究仅有Suzuki和Kim提及。Suzuki及Kim等发现RUNX3基因的表达与膀胱癌相关，但并未具体研究RUNX3基因表达与膀胱癌分期、肿瘤复发以及肿瘤淋巴结转移的关系，且他们的研究仅把RUNX3基因启动子区域的甲基化状况作为研究指标，缺乏对RUNX3基因表达水平的具体量化。我的导师周祥福教授在前期实验中应用RT-PCR、甲基化特异性PCR和非甲基化PCR检测膀胱癌T24细胞及正常膀胱组织中RUNX3基因的表达以及基因启动子区域CpG岛的甲基化状态。同时构建真核载体的pIRES2-EGFP-RUNX3质粒，转染膀胱癌T24细胞，流式细胞仪检测各组细胞凋亡率，结果提示膀胱癌T24细胞可能因RUNX3基因启动子区域CpG岛发生甲基化，致基因无法表达，转染野生型RUNX3抑癌基因后促进了膀胱癌T24细胞的凋亡。本课题采用RT-PCR及荧光定量PCR技术检查BTCC组织及正常膀胱组织中RUNX3基因的表达水平，同时应用WESTERN BLOT技术检测runx3蛋白的表达水平，明确BTCC组织中RUNX3基因的表达水平与肿瘤的分期、分级以及淋巴结转移之间的关系，探讨RUNX3基因为BTCC的诊断、治疗以及随访提供帮助的可能性。 研究目的： 1、明确RUNX3基因在正常膀胱粘膜组织和BTCC组织中的表达情况。 2、明确runx3蛋白在正常膀胱粘膜组织和BTCC组织中的表达情况。 3、探讨BTCC组织中RUNX3基因的表达水平与肿瘤临床分期、病理分级、淋巴结转移之间的关系。 方法与结果： 一、BTCC组织和正常膀胱粘膜组织的获取及组织总RNA和核蛋白的提取 在无菌条件下，所有标本均用剪刀剪碎，分两部分保存于冻存管，一部分用于提取组织总RNA，另一部分用于提取组织总核蛋白。分别应用总RNA提取纯化系统SV、GENMED组织可溶性总核蛋白制备试剂盒提取组织总RNA和总核蛋白结果：共获取41例BTCC组织标本和7例正常膀胱粘膜组织标本，每例标本均得到总RNA和总核蛋白。 二、RT-PCR检测RUNX3基因的表达情况 将48例标本的总RNA逆转录为cDNA，然后将cDNA产物进行PCR扩增RUNX3基因，进行琼脂糖凝胶电泳。 结果：41例BTCC组织有39例RUNX3阳性表达，7例正常膀胱组织有6例RUNX3阳性表达，BTCC组织与正常膀胱组织阳性表达率无明显差异(P>0.1)。 三、荧光定量PCR检测检测RUNX3基因的表达水平 构建真核载体的RUNX3-pRecerver-M01a质粒，分别用5中浓度梯度的质粒进行荧光定量PCR反应，拟合RUNX3基因的标准曲线。将48例总RNA标本的逆转录产物进行荧光定量PCR反应，得到相应的Ct值，应用标准曲线换算成相应的拷贝数。 结果：成功构建出RUNX3-pRecerver-M01a质粒，拟合的RUNX3基因标准曲线线性关系良好，得到各组织样本单位质量的拷贝数。正常膀胱组织RUNX3表达水平明显高于BTCC组织(P<0.05)，BTCC组织中RUNX3表达水平随着肿瘤分级的增高而降低(P<0.05)，随着肿瘤分期的增高而降低(P<0.05)，行根治行膀胱切除的24例样本，淋巴结转移组RUNX3表达水平明显低于无淋巴结转移组。 四、Western blot检测runx3蛋白表达应用Western blot免疫印迹法检测2例正常膀胱组织和2例BTCC组织中runx3蛋白的表达水平。 结果：2例正常膀胱组织和2例BTCC组织中runx3蛋白均有表达，但是BTCC组织runx3表带明显暗于正常膀胱组织，进一步验证了正常膀胱组织RUNX3表达水平高于BTCC组织。 结论： 1、RUNX3基因在BTCC组织和正常膀胱组织中均有表达，BTCC组织与正常膀胱组织RUNX3阳性表达率无明显差异(P>0.05)。 2、runx3蛋白在BTCC组织和正常膀胱组织中均有表达。 3、RUNX3基因在BTCC组织中的表达水平与患者的肿瘤的临床分期明显相关，肿瘤的分期越高，基因的表达水平越低(P<0.05)；RUNX3基因在BTCC组织中的表达水平与肿瘤的病理分级明显相关，肿瘤的分级越高，基因的表达水平越低(P<0.05)。 4、行根治性全膀胱切除的病例中，伴有淋巴结转移的BTCC组织中RUNX3基因表达水平明显低于无淋巴结转移的BTCC组织(P<0.05)。