梗阻性肾病，简单的说就是尿路梗阻引起的在肾功能上或（和）解剖上的损伤，是泌尿外科中较为常见的一种病。梗阻性肾病的发病机制中涉及许多种信号转导通路，其主要包括了肾小球纤维化（Glomerular fibrosis）、肾小管的纤维化（Renaltubulointerstitial fibrosis）以及上皮-间充质细胞转化（Epithelial-mesenchymaltransition,EMT）三种发病机制及模式。至今，肾小管性纤维化和上皮-间充质细胞转化致肾纤维化的作用及研究受到愈来愈多的重视和青睐。在肾小管性纤维化和EMT模式发生发展中，Toll样受体（Toll-like receptor, TLRs）在巨噬细胞的生物学信号通路转导和在促炎性细胞因子的释放过程中的作用和特点尤为突出重要。TLRs家族是非常重要的模式识别受体（PRR）,属于I型跨膜受体，分为胞外区、跨膜部分和胞质区三种结构区。TLRs主要分布于许多免疫细胞，如单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等，分布较为广泛，肾系膜细胞和肾小管上皮细胞（TEC）中分布较多。TLRs能特异性识别病原微生物（体）保守的抗原分子即病原体相关分子模式（PAMPS），从而激活激动细胞内信号传导途径，诱导炎症发生反应和激活免疫发生反应，如TLR4能够识别细菌脂多糖(LPS)，而TLR3能识别病毒的双链RNA。此外，Toll受体还能识别内源性配体，包括热休克蛋白（HSP）、细胞外基质成分等。肾纤维化过程中也有大量内源性配体被释放，紧接着激活了TLRs受体的下游信号后生成了大量的促炎性细胞因子，如白介素、肿瘤坏死因子、干扰素等，参与了肾脏纤维化的炎症及天然免疫反应并发挥关键及重要的作用。SHP-2是一种蛋白酪氨酸磷酸酶，在各种细胞中广泛表达，SHP-2在许多方面参与调控体内造血细胞功能，抑制信号级联发生反应，负向调控细胞的活化，调节免疫反应信号级联反应的减弱和终止。前期的研究发现了SHP-2可以抑制外源性TLRs的配体启动的活化信号如细菌脂多糖（LPS）、聚肌胞苷酸（poly I:C）等，且SHP-2还可以抑制poly I:C诱导的MAPK通路的激活活化。此外，TRIF是一种TLR-4信号转导中重要的调节蛋白，在此转导中， SHP-2通过与TRIF信号通路中的TBK-1蛋白竞争性结合抑制TRIF通路的活化，从而下游促炎性细胞因子的表达也得到了抑制。在复杂的体内免疫反应的过程中，SHP-2所介导的负向调控引起的促炎性细胞因子的表达谱的改变将会产生什么样的结果？SHP-2的这种对于TLRs信号通路的负向调控作用在梗阻性肾病致肾纤维化的复杂机制机理的背景下是否具有特殊的临床意义？鉴于目前尚无见SHP-2在肾纤维化病生反应中的调控作用，我们在本课题中首先繁育了巨噬细胞SHP-2基因条件性缺陷的小鼠，通过研究观察通过外源性配体活化其巨噬细胞TLRs后使促炎性细胞因子的表达及上调，在此基础上我们构建了小鼠的SHP-2质粒，通过上调SHP-2表达进一步验证了SHP-2对抑制巨噬细胞活化释放的促炎性细胞因子。最后，我们研究了体内实验中SHP-2对梗阻性肾病后致肾纤维化炎症反应的调节作用及其作用机制。一、巨噬细胞SHP-2条件性缺陷小鼠的繁育及稳定传代前期有人研究时利用RNA的干扰技术将小鼠的腹腔中含有的巨噬细胞中SHP-2这一基因沉默，达到70%及以上，然后利用poly(I:C)和LPS分别刺激巨噬细胞TLR3/TLR4使受体活化后从而促进促炎性细胞因子的释放及表达，结果显示SHP-2的基因沉默导致促炎性细胞因子的上调及高表达，并发现了TRIF这一分子在TLR-4信号通路转导中，SHP-2蛋白酪氨酸酶是抑制巨噬细胞释放的促炎性细胞因子的表达是通过其与TRIF信号通路中的TBK-1蛋白相结合而实现的。我们以巨噬细胞中的SHP-2为研究方向及突破点，采用了先进的Cre-loxP系统，需要涉及flox突变体小鼠的交配和Cre表达的小鼠路线，一旦Cre的表达特异性已经被证实，Cre转基因就能和floxed（两个loxP位点）的小鼠杂交并生出条件性敲除的小鼠。我们繁育的基因条件性敲除的小鼠正是在SHP-2基因外显子的两个位点加上loxP后，且表达Cre酶后即条件性敲除了SHP-2基因，最终成功繁育出巨噬细胞SHP-2基因条件性缺陷的小鼠并已经稳定遗传繁殖，为后期建立小鼠单侧输尿管梗阻（Unilateral UreteralObstruction,UUO）动物模型并奠定了实验基础，深入了解SHP-2负向调控巨噬细胞TLR-4信号干预慢性肾纤维化中的效果与作用机制，为设计干预慢性肾纤维化进程的靶点提供实验基础及临床依据。二、过表达SHP-2抑制巨噬细胞释放的促炎性细胞因子表达在本部分研究设计中，我们首先利用抽吸法抽取巨噬细胞SHP-2基因条件性敲除小鼠和同窝对照小鼠的巨噬细胞，利用菌脂多糖（LPS）即Toll样受体4（TLR4）识别的配体，刺激一定时间后观察巨噬细胞释放的促炎性细胞因子表达的差异，结果显示巨噬细胞SHP-2基因条件性缺陷小鼠的促炎性细胞因子如TNF-α、IL-1β、TGF-β1的表达较同窝对照组显著升高，后期我们采用pcDNATM3.1体系构建了SHP-2质粒和空质粒（EP），并且用SHP-2质粒转染野生型小鼠的巨噬细胞后使SHP-2上调且过表达，同时用空质粒转染作为对照组，转染48小时后用LPS刺激，结果显示SHP-2质粒转染后巨噬细胞SHP-2的表达较空质粒转染后表达显著上调且升高，而巨噬细胞释放的促炎性细胞因子如TNF-α、IL-1β、TGF-β1等表达较空质粒对照组表达显著降低。由此从另一方面证实了SHP-2减轻了LPS引起的炎症发生及反应，进一步说明SHP-2可以负向调控巨噬细胞TLR-4受体从而降低促炎性细胞因子的表达，减轻炎症反应，为小鼠单侧输尿管梗阻模型引起的致肾纤维化的体内实验提供一定的理论依据。三、SHP-2对肾纤维化的影响及其调控机制研究在本部分实验过程中，我们采用了巨噬细胞SHP-2基因条件性敲除的小鼠和同窝对照小鼠同时行单侧输尿管结扎术的动物模型来直接研究SHP-2对肾纤维化的影响。实验结果显示肾组织病理切片显示巨噬细胞SHP-2基因条件性缺陷小鼠的总胶原纤维含量、肾小管细胞的凋亡程度、肾实质细胞坏死的范围、肾脏组织病理的评分均显著高于同窝对照组小鼠的指标，western blot检测结果显示凋亡信号分子的活性表达均显著高于同窝对照组指标，而小鼠肾功能指标（血肌酐和尿素氮）无明显差异。随后，我们研究了巨噬细胞SHP-2基因条件性缺陷之后的这种损伤加重与炎症反应的关系，免疫组织化学结果显示在巨噬细胞SHP-2基因条件性敲除的小鼠在UUO术后的肾间质中存在大量巨噬细胞浸润，数量明显多于同窝对照组，有统计学差异，另外qPCR检测也显示巨噬细胞SHP-2基因条件性缺陷小鼠的肾脏巨噬细胞释放的促炎性细胞因子表达也显著升高，这些促炎性细胞因子都是TLRs信号转导通路的下游产物，这就为巨噬细胞SHP-2基因条件性缺陷小鼠病理损伤偏重的病理损伤提供了较为充分的解释与解答。本部分研究证实了巨噬细胞SHP-2条件性缺陷后小鼠的肾脏纤维化程度显著加剧，这种加剧的损伤主要是促炎性细胞因子引发的炎症反应引起的，而TLRs信号的过度过多的活化可能是造成炎症反应过重过剧烈的主要原因。综合上述三部分的研究，我们得出结论，SHP-2对单侧输尿管梗阻结扎术后产生的炎症反应过程有负向调控的机制及作用，其方式主要是通过抑制TLRs信号转导通路活化后并减少下游促炎性细胞因子的生成，最终抑制了肾脏纤维化的进程。确定了SHP-2的这种负向调控作用最后将有利于开发针对性的靶点治疗药物，为肾脏以及其他器官的纤维化提供新的治疗方法及治疗依据。