【摘 要】
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苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）是一种可以合成多种对昆虫、螨虫和线虫等无脊椎动物具有杀虫活性的晶体蛋白以及一些小分子杀虫活性物质的芽胞杆菌,现已成为微生物制剂开发的主要来源之一。目前对其杀虫晶体蛋白的杀虫机制已经有很多报道,但关于Bt作为一种昆虫病原菌在杀虫过程中与宿主互作的方式还不是很清楚。本课题组前期发现了一些致病因子及其作用方式如Bel、Bmp1、Nep1
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苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）是一种可以合成多种对昆虫、螨虫和线虫等无脊椎动物具有杀虫活性的晶体蛋白以及一些小分子杀虫活性物质的芽胞杆菌,现已成为微生物制剂开发的主要来源之一。目前对其杀虫晶体蛋白的杀虫机制已经有很多报道,但关于Bt作为一种昆虫病原菌在杀虫过程中与宿主互作的方式还不是很清楚。本课题组前期发现了一些致病因子及其作用方式如Bel、Bmp1、Nep1等,同时还发现Bt中的sRNA参与其对宿主的毒力调控。本研从sRNA的角度出发系统性研究sRNA对Bt致病性的影响及其调控方式。通过sRNA的靶标预测、构建sRNA缺失突变体、表型检测和q PCR检测,解析了sRNA对Bt致病性的影响方式,得到了以下结果。1、从34个潜在与毒力相关的sRNA中鉴定出14个毒力相关的sRNA通过对菌株YBT-1518中确认转录的34个可能与毒力相关sRNA进行靶标预测,发现29个sRNA存在与Bt致病性相关靶标,利用CRISPR-Cas9技术构建了其中11个sRNA缺失突变体,并对该11个和实验室前期构建的11个sRNA缺失突变体进行毒力鉴定,发现14个影响YBT-1518致病性的sRNA,其中6个sRNA缺失突变体毒力上升。8个sRNA缺失突变体毒力下降。2、毒力相关sRNA影响菌株YBT-1518的生长、cry基因表达和芽胞萌发对影响YBT-1518毒力的sRNA缺失突变体进行Bt致病性过程的表型检测,发现其中1个毒力增强的sRNA（sRNA20）缺失突变体生长力增强,1个毒力减弱的sRNA（sRNA6）突变体生长力降低;2个毒力减弱的sRNA（sRNA6、sRNA7）缺失突变体在体内的芽胞萌发率下降,1个毒力增强的sRNA（sRNA20）缺失突变体在体外的芽胞萌发率上调。3、毒力相关sRNA4通过抑制潜在靶标基因YBT-1518-26670的表达削弱菌株YBT-1518毒力sRNA4的缺失会导致YBT-1518的毒力显著上升,并且sRNA4的靶标YBT-1518-26670在ΔsRNA4/YBT-1518中的表达量上调。通过GFP标签确认sRNA4可以负调控YBT-1518-26670的表达。同时YBT-1518-26670的超表达会导致YBT-1518的毒力显著上升。4、毒力相关sRNA13可以通过抑制潜在靶标基因xre的表达增强菌株YBT-1518毒力sRNA13的缺失会导致YBT-1518的毒力发生显著的上升,并且其靶标基因xre的表达量在肌苷和线虫提取液诱导的芽胞萌发过程中均发生明显的上调,同时xre的缺失会导致YBT-1518的毒力显著增强。5、毒力相关sRNA20可能通过潜在靶标基因ger KA抑制芽胞萌发从而影响Bt毒力sRNA20的缺失会导致YBT-1518的毒力显著上升,同时其靶标基因ger KA的表达量上调。而ΔsRNA20/YBT-1518在肌苷诱导的萌发过程中芽胞萌发率显著上升。6、毒力相关sRNA20抑制潜在靶标基因spoⅤAD的表达负调控菌株YBT-1518的芽胞形成本研究发现毒力相关sRNA中均存在芽胞形成相关的靶标基因,通过对sRNA缺失突变芽胞形成率的测定和相关靶标基因的检测,发现sRNA20可以负调控spoⅤAD的表达,并且ΔRNA20/YBT-1518的芽胞形成率也显著高于YBT-1518,并且spoⅤAD的超表达会导致YBT-1518的芽胞形成显著上调。本研究鉴定的毒力相关sRNA丰富了Bt的毒力调控因子,加深了人们对Bt作为一种病原菌的认识。sRNA对Bt致病性调控机制的解析,完善了Bt中sRNA对毒力的调控机制,为构建高毒力Bt菌株提供了一定的理论基础,有望促进Bt在农林害虫防治方面的应用。毒力相关sRNA对Bt芽胞形成的调控,为优化Bt芽胞形成表型,改善Bt制剂的工业生产提供了一定的思路。
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