MicroRNAs（miRNAs）是一类在转录后水平行使基因表达调控功能的非编码RNA。在真核生物中,miRNAs的生成和功能已被研究的较为透彻,但是关于RNA病毒编码的miRNAs的生成和功能却鲜有报道。Bombyx mori cypovirus（BmCPV）是一类双链RNA病毒,其基因组由10个不连续的双链RNA片段组成,病毒感染家蚕幼虫会导致家蚕患中肠型脓病。迄今为止,BmCPV与宿主家蚕之间相互作用的分子机理尚不完全清楚。因此,本文通过研究BmCPV编码的miRNAs在病毒感染家蚕过程中的作用来探究BmCPV感染宿主的分子机理。1、BmCPV编码的小RNA测序本研究首先构建了BmCPV感染的家蚕中肠组织的小RNA文库,进行了小RNA测序,共得到34.7M原始序列数据和33.6M高质量序列数据,其中长度为18-23 nt的序列占总序列数据的72.76%。通过对小RNA测序结果进行分析,获得了BmCPV来源的12条miRNAs前体序列以及253条候选miRNAs序列。对其中高丰度miRNA针对家蚕基因组进行靶基因预测的结果显示,一个miRNA可以靶向家蚕多个基因,而同一个家蚕基因也可能被多个病毒miRNA调控;一些miRNAs可能通过调控家蚕免疫相关通路中关键基因的表达参与宿主与病毒之间的互作;发现NF-κB通路中NF-κB抑制因子激酶β亚基（Bm IKKβ,Bombyx mori inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase subunit beta）基因为miRNA BmCPV-miR-1的一个靶基因,该miRNA来源于BmCPV基因组第一片段RNA,其在靶基因m RNA上的结合位点位于3’UTR。本研究将BmCPV-miR-1及其靶基因Bm IKKβ确定为研究对象,探究它们之间可能存在的互作关系以及对BmCPV增殖的影响。2、BmCPV能够编码miRNAs以BmCPV-miR-1为例,研究BmCPV编码miRNAs的可能性。茎环RT-PCR被广泛应用于miRNA检测,本研究采用茎环RT-PCR检测蚕体中BmCPV-miR-1的表达。结果显示,在BmCPV感染的家蚕中肠组织中可以检测到BmCPV-miR-1,且q PCR定量检测发现随着感染后时间的增加,BmCPV-miR-1的检出量也越来越多,而在正常家蚕的中肠组织中检测不到BmCPV-miR-1。表明BmCPV-miR-1是由BmCPV编码生成,而不是BmCPV基因组RNA随机降解的产物。进一步构建了BmCPV-miR-1体外表达载体p IZT-mir-1,在细胞水平验证BmCPV-miR-1的生成。将表达载体p IZT-mir-1转染Bm N细胞,茎环RT-PCR在转染细胞中可以检测到BmCPV-miR-1,且q PCR定量检测发现在转染后24～72 h期间细胞中BmCPV-miR-1的表达量逐渐升高,而在转染空载p IZT的细胞中检测不到BmCPV-miR-1,表明BmCPV-miR-1由其前体BmCPV-mir-1产生。进一步证明BmCPV可以编码生成miRNA。3、BmCPV miRNAs的生成机制利用RNA干扰技术在Bm N细胞和蚕体内对BmCPV-miR-1的生成机制进行研究。将siRNAs转染Bm N细胞沉默与miRNA生物合成通路相关的Dicer-1（Dcr1）、Dicer-2（Dcr1）、Argonauate-1（AGO1）以及Argonauate-2（AGO2）基因的表达,采用q PCR技术检测转染p IZT-mir-1的Bm N细胞中目标基因沉默后BmCPV-miR-1的表达情况。结果显示,抑制细胞内AGO1、AGO2、Dcr1基因的表达,BmCPV-miR-1生成均减少;而当Dcr2基因的表达被抑制时,BmCPV-miR-1生成却增加,表明家蚕AGO1、AGO2、Dcr1、Dcr2蛋白与BmCPV miRNA的生成均存在一定的关系。对家蚕幼虫体腔注射siRNAs沉默Dcr1、Dcr2、AGO1以及AGO2基因的表达,采用q PCR技术检测相应基因沉默后BmCPV感染的蚕体中BmCPV-miR-1的表达情况。结果显示,在BmCPV感染的家蚕体内si-AGO1和si-AGO2并未对AGO1和AGO2基因产生预期的干扰效果;当Dcr1基因的表达被抑制时,蚕体内BmCPV-miR-1表达量下降;而当Dcr2基因表达被抑制时,BmCPV-miR-1的表达量增加。表明家蚕Dcr1蛋白在BmCPV miRNA生成过程中发挥重要作用,而Dcr2蛋白的表达与BmCPV miRNA的生成呈负相关。进一步检测了Dcr1基因、Dcr2基因沉默后BmCPV感染的家蚕体内病毒复制的情况。结果显示,当Dcr1基因被沉默时,BmCPV的增殖被抑制20～50倍;而当Dcr2基因被沉默时,BmCPV的增殖提高约0.8×10~4～1.4×10~5倍。表明与Dcr2基因相关的家蚕RNAi信号通路在抗病毒免疫过程中发挥重要作用,Dcr2基因的抑制促进BmCPV的增殖,从而导致BmCPV miRNA的表达显著上升。4、BmCPV-miR-1对靶基因Bm IKKβ的调控作用首先采用q PCR技术分别检测Bm IKKβ基因在转染p IZT-mir-1的Bm N细胞中和BmCPV感染的蚕体中的表达情况。结果显示,在转染p IZT-mir-1表达载体后24～72 h期间,Bm N细胞中Bm IKKβ基因的表达量均被抑制50%以上,且随着转染后时间的延长,抑制效果愈加明显。表明BmCPV-miR-1对Bm N细胞中Bm IKKβ基因的表达起负调控作用。在BmCPV感染家蚕后24 h,蚕体内Bm IKKβ基因的表达增加了约18倍,而在感染后48～96 h,蚕体中Bm IKKβ基因的表达均被显著抑制。这可能是因为BmCPV感染激活家蚕Imd信号通路,促进Bm IKKβ基因的表达进而促进IKK复合体的生成,故在BmCPV感染初期蚕体中Bm IKKβ基因表达上升。但随着感染进程的增加,BmCPV在蚕体中表达的BmCPV-miR-1逐渐增多,足以在转录后水平诱导Bm IKKβ基因的翻译抑制和m RNA降解,故在BmCPV感染后48～96 h蚕体中Bm IKKβ基因的表达被明显抑制。上述结果也表明BmCPV-miR-1对蚕体内Bm IKKβ基因的表达起负调控作用。进一步利用双荧光素酶表达载体系统在蛋白水平验证了BmCPV-miR-1对靶基因Bm IKKβ的调控作用。构建含有靶基因m RNA 3’UTR部分编码序列（包含BmCPV-miR-1结合位点）的表达质粒pmir GLO-IKKb-wt,并将miRNA结合位点突变构建质粒pmir GLO-IKKb-mut,分别与化学合成的BmCPV-miR-1 mimics共转染293T细胞,测定荧光素酶活性。结果显示共转染pmir GLO-IKKb-wt+BmCPV-miR-1 mimics的实验组293T细胞中相对荧光素酶活性降低了约40%,而共转染pmir GLO-IKKb-mut+BmCPV-miR-1 mimics的实验组和共转染pmir GLO-IKKb-wt+NC的阴性对照组中相对荧光素酶活性仍然接近100%。表明BmCPV-miR-1是通过与Bm IKKβ基因m RNA3’UTR调控区结合来抑制靶基因的表达。5、BmCPV-miR-1促进BmCPV的复制采用化学合成法合成了BmCPV-miR-1的模拟物（BmCPV-miR-1 agomirs）以及抑制物（BmCPV-miR-1 antagomirs）,并将其注射BmCPV感染的家蚕五龄幼虫,采用q PCR技术检测病蚕体内Bm IKKβ基因的表达以及BmCPV的增殖情况。结果显示,注射BmCPV-miR-1 agomirs后24～96 h期间,蚕体内Bm IKKβ基因的表达逐渐降低,说明在蚕体内提高BmCPV-miR-1的表达水平可以进一步增强BmCPV-miR-1对靶基因Bm IKKβ表达的抑制作用;而在注射BmCPV-miR-1 antagomirs后蚕体内Bm IKKβ基因的表达较NC对照组呈现明显增加,表明BmCPV-miR-1 antagomirs在一定程度上抑制了BmCPV-miR-1对靶基因的调控作用,进一步证明了BmCPV-miR-1对靶基因Bm IKKβ表达的负调控作用。BmCPV增殖的检测结果显示,不论是NC对照组还是agomirs亦或是antagomirs注射组,感染蚕体中BmCPV基因组RNA S2、S5和S10三个片段的表达均随着时间的增加而上升,意味着BmCPV成功侵染家蚕并在蚕体中进行复制。在注射后24～96 h期间,agomirs注射组蚕体中S2、S5和S10的表达均显著高于NC对照组,表明提高蚕体内BmCPV-miR-1的水平显著促进了BmCPV的增殖;而在antagomirs注射组蚕体中S2、S5和S10的表达较NC对照组下降,表明抑制BmCPV-miR-1的作用抑制了病毒的复制。以上结果表明BmCPV-miR-1可以显著促进BmCPV的增殖。综上所述,本研究证明了BmCPV可编码生成miRNA,BmCPV-miR-1是其生成的miRNA之一,且BmCPV miRNAs的生成依赖宿主的Dicer-1蛋白;BmCPV-miR-1通过与靶基因Bm IKKβm RNA的3’UTR结合,抑制Bm IKKβ的表达,从而调节宿主NF-κB信号通路,促进病毒的增殖。本研究的结果有助于理解BmCPV感染家蚕的分子机制,并为RNA病毒可以产生功能性miRNAs这一假说提供了新的证据。