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目的：1.分析中国浙江地区汉族人线粒体DNA(mitochondria DNA,mtDNA)ND3基因和以西方白种人为主要来源的剑桥标准序列(Cambridge Reference Sequence)之间的差异,查找ND3基因的多态性位点以及可能会导致2型糖尿病(type 2 diabetes.mellitus,T2DM)的突变位点. 2.分析线粒体基因组ND3基因变异与T2DM临床特征和并发症的关系,探讨线粒体ND3基因检测对于T2DM的诊断价值.
方法：
1.随机选择浙江籍汉族人群中确诊为T2DM的无血缘关系的门诊住院患者214名,详细记录每例患者的资料,包括姓名、性别、年龄、发病年龄、身高、体重、家族史、并发症及其它临床症状.同时选择无高血压、高脂血症、脑血管病、糖尿病及家族史、口服葡萄糖耐量正常的健康体检者以及学生体检154名作为正常对照.
2.对每例患者的血样作常规生化检测并提取全血基因组DNA,然后根据设计好的一对引物扩增出PCR产物,对产物纯化后,用直接测序法进行DNA序列检测,得到完整的ND3基因.与线粒体基因剑桥参考序列比对找出线粒体ND3基因的核苷酸变异位点.
3.分析T2DM组ND3基因变异位点,比较T2DM组与正常对照组各个变异位点的发生率,探讨NlD3基因变异与T2DM的关系.
4.将T2DM患者发生ND3基因变异的病例分成有家族史组和无家族史组,分析两组间的主要临床资料得出ND3基因变异与T2DM家族史的相关性.
5.对T2DM组发生ND3基因变异的病例分别按照有无视网膜病变、周围神经病变、肾病和高血压进行分组,探讨ND3基因变异与T2DM并发症的关系.
结果：
1.与线粒体基因剑桥参考序列比对,浙江地区汉族人T2DM患者及健康对照者线粒体ND3基因均存在大量变异.在214例T2DM组中有173例发现有mtDNA ND3基因核苷酸位点变异,共计19个变异位点;154例健康对照者中亦检出121例发现mtDNA ND3基因位点变异,共计17个变异位点.其中11个变异同时存在于T2DM组及正常对照组.G10320A只存在于正常对照组中,并且在T2DM组和正常对照组间的分布有差异(P=0.012),其它各位点在T2DM组和正常对照组间的分布均无统计学意义(P>0.05).
2.在T2DM患者组中发现的19个变异位点,其中有11个变异位点在线粒体数据库(www.mitomap.org)已经报道过.这19个变异位点中有4个为错义变异,对这4个错义变异在不同物种之间进行保守性分析,它们都不在ND3基因的进化保守区域内,它们中3个变异(T10084C、A10089G和A10398G)所编码氨基酸的极性发生改变,这3个错义变异酶亚单位二级结构发生不同程度的改变.
3.我们研究发现,在T2DM患者组和正常对照人群组中mtDNA ND3中变异位点A10397G的出现总是伴随着A10398G和c10400T两变异位点同时出现而出现,变异位点C10400T的发生也常伴随着变异位点A10398G的出现.虽然A10397G和C10400T两变异位点本身并不引起氨基酸改变,但变异位点A10398G会导致氨基酸改变以及氨基酸的极性发生改变.同时只在正常对照组人群中检出5例G10320A位点变异,且这5例含有G10320A位点变异均同时伴随着G10310A位点变异.
4.把173例含有mtDNA ND3变异位点的患者分为有家族史和无家族史组,并作统计学分析,发现G10310A在两组间分布有统计学意义(P<0.05).有家族史组与无家族史组比较:有家族史组女性患病率显著升高,平均发病年龄、平均体重指数显著降低(P<0.05):而生化指标中糖化血红蛋白(HbAlc)较无家族史组升高.
5.把含有mtDNA ND3基因变异的T2DM患者结合并发症分析.按并发症分组分析各组间主要临床生化资料的差异.T2DM并发视网膜病变组较无视网膜病变组女性患者发病率高、平均发病年龄降低、有家族史人数增加、依赖胰岛素治疗人数更多(P<0.05);生化指标中HbAlc较无视网膜病变并发症组升高、HDL-c较无视网膜病变并发症组降低、低密度脂蛋白(LDL-c)较无视网膜病变并发症组升高.有周围病变并发症组HbAlc、空腹血糖(FBG)、餐后2小时血糖(P<,2>BG)、LDL-c均较无周围神经病变组升高(P<0.05).有肾病并发症组患者平均发病年龄较无肾病并发症组患者早、有家族史人数较无肾病并发症组增加、FBG较无肾病并发症组增加、使用胰岛素治疗人数增加(P<0.05),同时还发现有肾病并发症组的患者总胆固醇比无肾病组患者高,两组问差异有统计学意义.有高血压病变并发症组患者平均年龄、平均发病年龄、平均体重指数均较无高血压并发症组患者升高,使用胰岛素治疗的人数较无高血压并发症组增加(.P<0.05).
6.对于含有mtDNA ND3基因变异的T2DM患者的各项并发症之间的关系发现,三种糖尿病微血管并发症(视网膜病变、周围神经病变、肾病变)关系密切,常同时并发.但有高血压组和无高血压组两组间合并视网膜病变、周围神经病变和肾病的发生率间差异均无统计学意义(P>0.05).
结论：1.浙江汉族T2DM人群线粒体ND3基因存在大量变异位点,G10320A只存在于正常对照组中,该位点可能对糖尿病有保护效应.
2.T10084C、A10089G、T10321C、A10398G可能与浙江汉族人T2DM的发病有关,有待进一步深入研究.
3.人群中mtDNA ND3中变异位点A10397G、A10398G和C10400T之间的相互作用和G10310A和G10320A之间的相互作用以及它们与其它线粒体疾病的关系还有待于进一步研究.
4.线粒体ND3基因变异可能与T2DM的家族遗传特性、临床表现及并发症密切相关.
5.mtDNA变异机理非常复杂,具有表型异质性.携带有不同变异位点患者的临床表现各不相同,即使携带有同一变异位点因个体不同而临床表现差异很大.
6.三种糖尿病微血管并发症(视网膜病变、周围神经病变、肾病变)关系密切,常同时并发,提示我们对有可能同时并发的微血管病变应引起高度重视.因此,本研究认为检测线粒体ND3基因对于早期预防并发症的发生,判断预后,指导治疗,减少T2DM的致残率和死亡率具有重要意义.