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诱导分化是近年来肿瘤治疗领域研究热点之一。维甲酸是最早确认对急性早幼粒细胞白血病有诱导分化作用的诱导分化剂，在临床广泛应用于白血病的治疗。随后又发现了一系列对血液肿瘤有诱导分化作用的诱导分化剂。90年代后，诱导分化治疗的研究由单纯血液病扩展到了实体瘤。但由于实体瘤在组织结构和肿瘤生物学特性上更为复杂，且大都缺乏理想的特异性分化标志，目前有关研究和应用相对较少。
本课题组在前期实验中发现，一种常见的生物毒素--霍乱毒素( Choleratoxin)对胶质瘤有诱导分化作用。Cholera toxin(10 ng/ml)处理大鼠胶质瘤C6细胞株及原代培养的人胶质瘤细胞后，胶质瘤细胞增殖能力明显受到抑制，细胞形态表现出明显的分化特征:细胞伸展变扁，胞体变大，胞核变小，核浆比减小，突起增多而且细长。同时检测胶质瘤细胞的生长和分化以及细胞周期调节蛋白表达，发现胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达增加、核增值抗原(PCNA)表达降低，流式细胞术分析提示细胞群有G1期阻滞、S期细胞减少，且无明显细胞凋亡和死亡。
为进一步了解诱导分化过程中胶质瘤细胞的基因表型变化始末，以及随之而来的蛋白质合成及功能的变化，从而能找到更多的切入点以加强或辅助诱导分化疗法来治疗恶性胶质瘤，对Cholera toxin诱导分化胶质瘤细胞的全过程进行了基因芯片表达谱分析。在芯片分析基础上，选择了在诱导分化初期即有明显差异表达的核孤儿受体家族(NR4As)2个成员:NR4Al(NLJR77)、NR4A3(NOR1)进行功能学研究。利用SiRNA技术和质粒过表达，观察了NR4As缺失及过表达情况下，胶质瘤细胞C6的分化状态。为进一步阐明NR4As的作用机制，构建了NORl诱饵基因真核表达质粒，利用酵母双杂交和免疫共沉淀技术，寻找并验证能与其相互作用的蛋白质因子，并初步探明了NORl与其作用辅助因子SNF5的作用结合部位。
第一章霍乱毒素诱导分化胶质瘤细胞相关基因表达谱研究
方法:从Cholera toxin诱导前、诱导后3、6、12、24、48h的样品总RNA中分离得到总mRNA，进行cDNA array芯片分析。
结果:在420105*的31043个基因的表达数据中，与未发生分化的C6细胞相比，诱导分化的3、6、12、24和48小时，mRNA转录水平表达有明显差异的基因数量分别为:61/123、149/192、266/247、682/491、506/291(上调<2倍/下调<2倍)；在观察全过程(48h)持续差异表达的基因数量为:22/7，其中在早期(≤12h)持续有差异表达的基因数量为28/18。对这些差异表达基因进行生物信息学数据库检索，进行初步分类，建立了初步的诱导分化相关基因表达谱。
结论:
1.随着分化的进行，转录水平发生变化的基因由少到多，最后呈爆发形势，说明从最初的少数基因变化到后期，是一个级联放大、互为因果的过程。
2.在诱导分化过程中，促进细胞进入增值周期的调节因子如cyclin D，CDK2表达下降，促胶质瘤因子PDGF表达下调；TGF-β、Integrins等协调内环境稳定的因子发生上调，与分化特征相一致。
第二章核孤儿受体NR4A1，NR4A3在胶质瘤细胞分化中的作用
Cholera toxin诱导胶质瘤细胞株C6的分化过程中，在芯片数据上显示NR4A1、NR4A3在早期(3h)时即有明显升高，且此变化贯穿检验的全部时程，提示NR4A1、NR4A3在C6分化过程中快速反应，表现活跃，有可能参与了分化的始动环节。
方法:大鼠C6细胞株培养；相差显微镜术观察细胞形态；siNUR77转染细胞并检测转染率，pCMV-Entry Vector(C-terminal Myc-Flag tag)过表达NUR77； RT-PCR、Western blotting分别检测NUR77、GFAP、PCNA蛋白水平，流式细胞术分析细胞周期改变。激光共聚焦显微技术观察诱导分化后NOR1的表达和亚细胞定位。
结果:mRNA和蛋白水平检测表明，NOR1和NUR77在C6细胞诱导分化初始便呈明显上调表达，与芯片结果一致。SiNUR77可以在一定程度上取消Cholera toxin诱导分化胶质瘤细胞C6的作用；过表达NUR77使得C6胶质细胞发生一定的形态学和细胞周期改变，与Cholera toxin诱导分化胶质瘤细胞C6分化作用相类似。Cholera toxin诱导分化胶质瘤细胞C6过程中，NOR1在核内高表达且浓集，并没有移位出核。
结论:NR4As家族成员:NR4A1(NUR77)，NR4A3(NORl)在Cholera toxin诱导分化胶质瘤细胞C6中起到了重要作用，此作用可能与其核内调控下游基因转录相关，而非诱导凋亡。
第三章NOR1转录辅助因子的筛选和确认
方法:利用NOR1功能域结构，设计了2个诱饵基因片段并构建真核表达质粒，通过酵母双杂交、免疫共沉淀等技术在小鼠胎脑cDNA文库中寻找能与Norl起作用的蛋白因子。并设计了一系列的NOR1截短体序列，以确定NOR1与其辅助因子的作用结合部位。
结果:根据NOR1功能域结构设计2条诱饵(bait)并构建融合质粒，其中pGB-2N2没有自激活作用。利用其在小鼠胎脑cDNA文库中进行筛库，得到2条阳性序列的猎物( prey)基因，分别为LCK和SNF5(SMARCBl)；共转染证实SNF5与NOR1有蛋白质相互作用。系列截短体与SNF5的酵母双杂交实验，证明与SNF5结合的部位为NOR1的DNA结合区(DNA binding domain，DBD)。
结论:染色体塑形蛋白SNF5通过DBD区域与NOR1结合，辅助其发挥转录调节作用。