【摘 要】
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α-1,2-葡聚糖存在于蓝藻体内,帮助其抵抗高盐、低温等逆境,在化妆品行业和医药行业具有巨大应用潜力。然而,α-1,2-葡聚糖合成过程中的关键酶尚未鉴定。本文从细长嗜热聚球藻鉴定出Uniprot编码为Tll1591的翻译蛋白就是α-1,2-葡聚糖合酶,对其晶体结构进行了解析,鉴定了该酶催化活性。具体研究结果如下:首先构建Tll1591的p ET28a重组质粒,转化至大肠杆菌Escherichia
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α-1,2-葡聚糖存在于蓝藻体内,帮助其抵抗高盐、低温等逆境,在化妆品行业和医药行业具有巨大应用潜力。然而,α-1,2-葡聚糖合成过程中的关键酶尚未鉴定。本文从细长嗜热聚球藻鉴定出Uniprot编码为Tll1591的翻译蛋白就是α-1,2-葡聚糖合酶,对其晶体结构进行了解析,鉴定了该酶催化活性。具体研究结果如下:首先构建Tll1591的p ET28a重组质粒,转化至大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）体内,经扩大培养、IPTG诱导蛋白过表达、Ni-NTA纯化并浓缩后,获得高纯度蛋白。将纯化后的蛋白结晶,筛选出适合于X-射线衍射的晶体,最终解析出其晶体结构。经薄层层析（TLC）试验发现,Tll1591可以将UDP-葡萄糖（UDPG）上的葡萄糖基团转移至蔗糖或已有的α-1,2-葡聚糖上形成更长的α-1,2-葡聚糖。这种酶法合成的α-1,2-葡聚糖与从蓝藻Nostoc sp.PCC 7120中纯化出的α-1,2-葡聚糖相同。另外,当UDPG与蔗糖的摩尔比相对较高时,Tll1591可以将多余的UDPG水解成二磷酸尿苷（UDP）和葡萄糖,表明UDPG与蔗糖的摩尔比可调节蓝藻体内α-1,2-葡聚糖的合成。本文解析了Tll1591与UDP和蔗糖的共晶体结构。该结构表明,在催化中心边缘的氨基酸形成了一个规则的圆圈,从而允许蔗糖或具有右手螺旋结构的α-1,2-葡聚糖进入催化位点。在共晶体结构中,Tyr18和Arg179是UDP和蔗糖的临近氨基酸,这提示这两个氨基酸直接参与催化。研究发现这两个氨基酸的点突变体（Y18F和R179A）的酶活性极低,这证明Tyr18和Arg179起关键的催化作用。另外,酶温度梯度试验表明,Tll1591在60℃时活性最高;p H梯度试验表明,该酶在p H 4.5至p H 10的广泛p H范围内均有活性。综上所述,本文证明了Tll1591是一种新颖的α-1,2-葡聚糖合酶,首次报道了Tll1591与UDP和蔗糖的共晶体结构,为分析这种酶的催化机制及工业应用提供了一定的理论依据。
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