随着视网膜移植研究的不断深入，供体材料的选择受到越来越多的关注。人类视网膜移植供体材料来源相对受限，在一定程度上限制了这一技术的开展。分离胚胎期和新生期视网膜进行体外保存，建立视网膜移植的供体材料库，为视网膜移植提供充足的材料来源，正在成为视网膜移植研究领域的新热点。然而，由于胚胎期和新生期视网膜神经细胞的动态生长发育特性，使得供体材料的年龄及其体外保存时期成为供体选择的关键因素。研究胚胎期和新生期视网膜神经细胞体外动态生长发育规律，明确其在体外的最佳生存时期，将为视网膜移植供体材料的选择提供理论依据。本实验建立了视网膜神经细胞体外培养体系，观察了新生小牛视网膜神经元体外发育过程中形态学、免疫细胞化学特性的动态变化规律，深入探讨了培养的视杆细胞的电生理特性，明确了视网膜神经元体外最佳生存期。 一、视网膜神经元形态学特性的动态发育规律 刚贴壁的视网膜神经细胞，形态较单一，没有神经突起。随着培养时间的延长，神经元开始伸展出神经突起，细胞的大小和形状呈现出不同的形态学特点。到培养20天时，细胞已具备成熟神经元的形态特征，根据细胞形态的不同，分为多极神经元、带有顶端突起的细胞和无突起细胞。不同的神经元细胞，胞体的大小、形状以及神经突起的数量、伸展方式、突博士学位论文摘要起分支的方式各不相同。神经突起的生长、延伸及数量的增多、形成分枝等形态学上的变化，是神经元在体外生长发育的重要标志。培养20天时，神经元之间通过突起彼此联系，神经突起的末段可见呈扇形膨大的生长锥。生长锥是所有轴突、树突分枝活跃生长的尖端。培养体系中生长锥的出现，标志着神经元处于良好的生长发育状态。培养30天以后，多极神经元细胞逐渐衰老。培养40天以后，有顶端突起的细胞和无突起细胞开始衰老，到培养90天时，神经元细胞胞体皱缩变圆，突起萎缩，神经元退化变性、很快死亡。从本实验的培养结果看，培养20天的神经元具备成熟的形态学特性。 本实验采用含低浓度胎牛血清的培养液，不仅能提供细胞生长增殖所必须的各种生长因子，而且也降低了血清中抑制物的浓度。同时，低浓度的血清能够抑制胶质细胞的过度增殖，有利于神经元的生长。本实验采用神经细胞混合培养体系，不去除神经胶质细胞，神经胶质细胞能够分泌神经元所需要的细胞因子，不同种类的神经元细胞之间也可以相互建立联系，传递生长信号，相对于单一种类的视网膜神经细胞的培养，所需的培养条件简单，不需要添加生长因子，神经元也可在体外长期存活。 二、不同种类的视网膜神经元免疫细胞化学特性的动态发育规律 为明确不同种类神经元的体外生长发育规律，本实验应用特异性抗体标记神经元，观察其形态学和免疫细胞化学特性的变化规律。用calbindin一D28K标记视网膜水平细胞，PKC标记视杆一双极细胞，CD90抗体标记视网膜神经节细胞，Rho4DZ抗体标记视杆细胞，GFAP抗体标记神经胶质细胞。结果显示，培养10天的calbindin一D28K阳性细胞还不具备典型的形态特征，培养20天时，阳性细胞由细胞体向外伸展出多个细长的神经突起，有的突起带有分叉，突起的数量达2一6个，阳性细胞的形态特征与成熟的视网膜水平细胞一致。定量分析显示，培养20天的阳性细胞免疫博士学位论文摘要反应的强度最高。体外培养30天和40天时，细胞虽然保持成熟神经元的形态特征，但阳性细胞的免疫反应强度较培养20天时下降，提示细胞内功能性蛋白质calbindin--D28K的表达己经减弱，细胞开始衰老。本研究结果表明，培养20天的视网膜水平细胞具备形态学及免疫细胞化学上的成熟特征，为发育最好的神经元。培养20天是水平细胞的体外最佳生存期。 培养10天的PKc阳性细胞神经突起较短，还不具备成熟视杆一双极细胞的形态特征。培养20天时，阳性细胞胞体较小，胞体一端伸出较短的丛状突起，另一端为一个细长的神经突起，这与成熟的视杆一双极细胞具有的从状树突及细长的轴突的形态特点相一致，定量分析其免疫反应强度最高，表明此时视杆一双极细胞已发育为成熟的神经元。从培养30天开始，视杆-双极细胞的免疫反应强度下降，提示PKC蛋白的表达水平下降，此时细胞虽然保持成熟神经元的形态特征，但细胞产生特异性蛋白质的能力己下降，细胞开始衰老。培养20天是视杆一双极细胞的体外最佳生存期。 在哺乳动物视网膜，Thy吐是视网膜神经节细胞的特异性标记物，本实验应用CD90抗体识别细胞膜上的Thy一1 .1抗原。体外培养10天，Thy一1 .1阳性细胞胞体较其他神经元大，有一个较粗壮的神经突起，细胞体和突起均呈免疫反应阳性，这同以往观察到的视网膜神经节细胞的形态及免疫细胞化学特点一致。培养20天、30天及40天时，未发现有Thy一1 .1阳性的神经节细胞，提示神经节细胞在本培养体系下的生存期是10天。研究表明，视网膜砒1 ler细胞不仅能促进RGcs的存活和轴突的再生，而且能减轻缺氧和兴奋性神经毒对RGC:的损害，起到神经保护作用。本实验采用视网膜神经细胞混合培养，不去除神经