人骨形成蛋白(hBMP)家族中目前已发现的共有13种hBMP分子，除hBMP-1外，都属于TGF-p超家族成员。最初由于它们具有诱骨活性而被发现和重视，新的研究表明，人骨形成蛋白不仅在治疗骨缺损和骨不连方面显示出极大的应用价值和潜力，而且在胚胎发生、神经细胞分化、造血组织发育、精子发生、胎盘形成，以及诱导细胞凋亡等诸多方面都有着重要的作用，故一度成为国内外学者研究的热点。人们先后利用基因工程的方法在大肠杆菌以及COS、CHO、昆虫等真核细胞中表达该基因，但截止目前国内外尚未见到有用乳腺细胞表达hBMP的报道。对于功能基因hBMP-3的获取，国内外学者大多采用从人cDNA文库中筛选的方法。利用筛库的方法获得基因有一定的优点，但这种方法也存在着工作量大，前期投入高等缺点。鉴于此，本研究拟通过RT-PCR的方法克隆该基因，为利用转基因动物乳腺生产人骨形成蛋白创造条件。 本实验以人骨纤维肉瘤为实验材料，采用RT-PCR技术对人骨形成蛋白3基因的部分cDNA进行了扩增、克隆、序列测定和分析。实验首先用TRIZOL试剂成功地从液氮中保存的人骨纤维肉瘤组织中分离得到总RNA。将总RNA反转录成为CDNA。以CDNA为模板，根据人骨形成蛋白3基因的cDNA序列设计引物(正链引物：5′-acatcgctaaccaagtctga-3′，20-nt；负链引物：5′-gagcaataataggcatcaaag-3′21-nt)，扩增出一条长度约为850bp的特异片段。PCR扩增条件为：94°C变性2min，然后以94℃变性30sec，52.5℃退火30sec，72℃延伸1.5min为1个循环，循环35次，最后于72℃再延伸lOmin。使用DNA胶回收试剂盒回收和纯化该片段。将回收片段与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5Q，经过蓝白斑筛选，HindⅢ酶切和PCR鉴定后测序。结果显示所得到的片段大小为845bp，与Genebank中公布的hBMP-3基因相应片段的序列同源性为100％，完全吻合。根据845个核苷酸序列推导出相应的280个氨基酸的序列。 以上实验结果证明：我们已经成功地扩增、克隆了人骨形成蛋白3(hBMP-3)基因cDNA的大部分序列，为开展利用转基因动物乳腺生产人骨形成蛋白创造了条件。