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甘油是一种重要的轻化工原料,已广泛应用于化妆品、牙膏、烟草、香精、水性油墨、印染纺织、涂料、合成树脂、皮革、造纸、制药、食品和国防等十多个领域的1700多种产品。发酵法生产甘油与甘油的其它生产方法相比有着特有的优势。耐高渗产甘油假丝酵母WL2002-5是本研究室拥有自主知识产权的甘油生产菌株,是迄今为止国内外报道的生产性状最优良的甘油生产菌株,其发酵生产甘油具有高产量、高转化率和高回收率等优点,已经应用于大规模的发酵甘油工业生产中。
胞浆3-磷酸甘油脱氢酶是酵母甘油合成的关键酶,有研究表明,提高甘油合成的最直接的办法就是过量表达编码3-磷酸甘油脱氢酶GPDH的同工酶Gpd1的基因GPD1。在前期研究的基础上,本文采用PCR的方法扩增了产甘油假丝酵母胞浆3-磷酸甘油脱氢酶编码基因及侧翼序列CgGPD1,构建了含CgGPD1基因不同拷贝数的根癌农杆菌双元载体pCAM3300-zeocin-CgGPD1,pCAM3300-zeocin-CgGPD1-CgGPD1和pCAM3300-zeocin-CgGPD1-CgGPD1-CgGPD1,并将其转入大肠杆菌JM109中,初步研究了其在不同浓度NaCl、葡萄糖胁迫下表达情况。
由于产甘油假丝酵母是工业生产菌株,其在细胞壁结构上的特殊性等原因使得常规的酵母转化方法转化效率很低。为此本文将构建的含CgGPD1基因不同拷贝数根癌农杆菌双元载体电击转入根癌农杆菌LBA4404中,利用根癌农杆菌介导转化的方法将单拷贝CgGPD1成功转入产甘油假丝酵母中,得到含CgGPD1基因的产甘油假丝酵母转化子并命名为Candidaglycerinogenes-CgGPD1(C.g-G)。
通过筛选得到一株高产甘油的产甘油假丝酵母转化子C.g-G8,实验表明CgGPD1全长基因的插入并没有改变C.g-G8的生长过程,转化子C.g-G8的平均耗糖速率明显对原始菌株C.g要快,CgGPD1全长基因的整合在一定程度上提高产甘油假丝酵母甘油产量,其甘油产量比原始菌株提高了12.08%;其甘油发酵时间比原始菌株发酵时间缩短6h;其甘油合成速率比原始菌株提高了20.49%。C.g-G8在发酵过程中Gpd1p酶活也维持在较高的水平,转化子的平均酶活比原始菌株的平均酶活提高27.55%,这说明通过根癌农杆菌介导转化的方法将CgGPD1全长基因转入产甘油假丝酵母并进行了有效的表达。