背景肌腱是连接骨和肌肉的致密结缔组织,其在肌肉和骨之间具有传递动能的作用,由于肌腱细胞周围包裹有纵行排列的胶原纤维束,因此肌腱具有较强的抗拉强度。但是肌腱组织鉴于这种力学强度较高的组织结构,其血管比例较少,因此损伤后不利于组织的修复和再生。临床上治疗肌腱急性断裂或损伤常常采用外科手术来修复。随着缝合方法的不断改进,以及缝合材料的迅猛发展,肌腱缝合后的再断裂率显著下降。但对于肌腱损伤修复后的固定方法,以往的临床经验则是采用非功能位的固定,即松弛位,主要考虑到缝合后早期受力会使得缝合处的肌腱再断裂或者近端和远端链接较差。但随着科学技术的发展,功能位固定的提出也是对传统方法的一种挑战。功能位固定使得肌腱修复后处于持续的温和牵张刺激中。以往的实验研究表明,体外离体对跟腱、髌腱等进行牵拉刺激后,其胶原含量较未施加牵拉刺激的水平高。那么功能位固定的这种能够对修复后的肌腱产生持续牵张应力刺激能否对肌腱的修复带来益处,它加速肌腱组织修复的机制则是本文研究的重点。阐明其潜在的机理,有利于将功能位固定更广泛的应用于肌腱损伤修复后,为临床提供新的治疗方法和手段。目的探讨兔跟腱急性离断修复后功能位固定对其修复效果的影响以及其潜在的作用机理。方法本研究分两部分进行。第一部分为探讨兔跟腱急性损伤修复术后持续牵张应力刺激对跟腱的生物力学和相关生长因子表达影响。第二部分为探讨持续牵张应力刺激对肌腱干细胞向肌腱细胞定向分化的研究。第一部分,研究对象为成年健康雄性新西兰白兔,随机分为4组,每组42只,即A、B、C和D组。A组给予跟腱离断缝合术后踝关节功能位固定。B组给予松弛位固定。C组不给于固定,自由活动。D组为正常对照组。选择术后第7d、14d、28d三个时间点检测各组兔跟腱修复组织力学性能,HE、苦味酸-一天狼猩红染色观察修复的肌腱组织形态及胶原分布,彩超观察各组跟腱组织的术后7d,14d和28d的相关指标。透射电镜观察各组跟腱组织术后28d时的超微结构。采用实时定量PCR和ELISA法检测修复肌腱组织的相关基因和蛋白的水平。第二部分,体外分离培养兔跟腱肌腱干细胞,采用成骨、成软骨、成脂肪等诱导液进行诱导并染色鉴定其多向分化潜能。采用流式细胞术检测分离的肌腱干细胞特征性蛋白水平。采用持续牵张应力刺激仪对体外分离培养的肌腱干细胞进行2% strain、4% strain和6% strain的持续牵张应力刺激。在施加刺激后24h和48h时检测细胞成肌腱分化相关基因和蛋白表达水平。结果第一部分,术后28d时A组跟腱损伤处可见大量胶原纤维形成,纤维排列较整齐,炎性细胞较少见到。C组兔跟腱修复处也可见有大量胶原纤维形成,纤维结构排列比A组较差。术后第7d、14、28d时,四组兔跟腱最大载荷、抗拉刚度、最大断裂应力差异均具有统计学差异(P<0.05),A组均优于B组和C组(P<0.05)。第28d时A组最大载荷、抗拉刚度、最大断裂应力的值分别为269.32±28.43(N),25.63±1.43(N/mm)和9.78±2.53(Mpa)。在第28d时,A组兔跟腱Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的比例均已非常接近正常兔跟腱,然而C组的Ⅰ型胶原比例略低于A组,B组最低,仅为86.32%。术后第7d时,A组兔跟腱组织中,COL Ⅰ、COL Ⅲ、TGF-β1、bFGF、PDGF和IGF-1基因表达水平显著升高。高于B组、C组和D组,而A组VEGF表达量较B组和C组低(P<0.05)。在术后第28d时,各组COLⅠ、 COL Ⅲ、TGF-β1、bFGF、PDGF、VEGF和IGF-1基因表达水平均有不同程度的下降,但仍高于D组水平(P<0.05)。ELISA检测蛋白水平结果显示术后第7d时,A组COL Ⅰ、TGF-β1、bFGF、PDGF蛋白水平显著高于B组和C组(P<0.05)。而四组VEGF口IGF-1蛋白水平差异则无统计学意义(P>0.05)。术后第14d时,A组和C组COLⅠ、bFGF和PDGF蛋白水平又有所上升,且显著高于B组(P<0.05)。第二部分,肌腱干细胞呈鹅卵石样平铺于培养瓶底,并且呈克隆样生长。番红O、茜素红和油红O染色显示肌腱干细胞具有向成软骨、成骨和成脂分化的潜能。2%牵张应力下,肌腱干细胞在24h时Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原基因表达有明显的上升,然而在48h时,其这两个基因表达未见明显变化(P>0.05),而TNC和SCX两个肌腱细胞标志性基因及蛋白在48h时反而表达水平下降。在4%持续牵张应力刺激下COL Ⅰ COL Ⅲ、TNC和SCX均有显著的上升,并且48h时表达水平也高于24h时(P<0.05)。而6%的持续牵张应力刺激未能使肌腱干细胞的COL Ⅰ、COL Ⅲ、TNC和SCX基因及蛋白表达显著升高,显著低于2%和4%持续牵张应立组(P<0.05)。结论1、兔跟腱急性断裂修复后功能位固定较非功能位固定更能够促进肌腱组织胶原含量的增加以及纤维结构的恢复。2、兔跟腱急性断裂修复后功能位固定较非功能位固定更能够促进修复跟腱组织生物力学性能的提高。3、兔跟腱急性断裂修复后功能位固定较非功能位固定更能够促进修复跟腱组织的肌腱相关生长因子基因和蛋白水平的提高。4、体外分离培养兔肌腱干细胞,其可呈克隆样生长,具有多向分化潜能。5、4%持续牵张应力刺激能够有效的诱导肌腱干细胞向肌腱细胞分化。