肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是我国最常见的恶性肿瘤之一,但目前总体治疗效果不理想。虽然目前对其发病机制的了解较前有了明显进步,但还存在许多需要研究的地方。我们在前期的研究中已发现了1条在肝癌中高表达但其功能未知的基因(登录号BC047440),并发现其在肝癌组织中的表达高于癌旁组织,且该基因的功能与肝癌生长增殖有关。近年来的研究证实,NF-κB在肝癌的发生和发展中具有重要的作用。因此,本课题拟探讨BC047440基因是否通过调节NF-κB促进肝癌细胞的增殖,并进一步探讨BC047440基因调节NF-κB的可能机制。目的:构建BC047440-siRNA表达载体并将之转染入HepG2细胞中以沉默BC047440基因,在此基础上观察沉默后HepG2细胞中的基因表达谱的改变和NF-κB活性的变化,探讨BC047440基因调控HepG2增殖的机制,进一步了解该基因在肝癌中的作用。方法:(1)利用生物信息学技术在线设计特异性BC047440基因的shRNA,在体外构建和克隆BC047440的shRNA表达载体(pGenesil-1-BC047440-siRNA);(2)用定量PCR观察沉默HepG2细胞中BC047440基因后BC047440基因的mRNA表达情况;(3)用MTT法观察沉默BC047440基因后对HepG2细胞增殖的影响并绘制生长曲线;(4)用Western Blotting法观察NF-κB相关蛋白p50表达的改变;(5)通过EMSA和荧光素酶试验检测沉默HepG2细胞中BC047440基因后NF-κB的核转位和NF-κB活化情况;(6)利用人全基因组基因芯片观察沉默BC047440基因后相关基因表达谱的改变并进行分析,筛选有关基因并进行PCR验证;结果:(1)以BC047440cDNA序列的编码区第469,572,616位为靶点,成功地构建了3条BC047440-siRNA真核表达载体: Pgenesil-1-BC047440-1-siRNA、Pgenesil-1-BC047440-2-siRNA、Pgenesil-1-BC047440-3-siRNA。( 2 )构建的三条Pgenesil-BC047440-siRNA均能有效降低HepG2细胞中的BC047440的mRNA表达水平,其抑制率分别为80.22% , 58.63%和74.22%。( 3 ) MTT法显示Pgenesil-1-BC047440-siRNA沉默HepG2细胞中的BC047440基因后,和对照组比较HepG2细胞的增殖受到抑制。(4)Western Blotting结果发现沉默BC047440基因后HepG2细胞的的p50蛋白含量低于对照组。(5) Pgenesil-1-BC047440-siRNA沉默HepG2细胞中的BC047440基因后,HepG2细胞中的NF-κB核转位明显低于野生株HepG2。(6)Pgenesil-1-BC047440-siRNA沉默BC047440基因后HepG2细胞的荧光素酶和海肾荧光素酶活性比值只有野生株的1/4,提示NF-κB活性明显的受到抑制。(7)沉默BC047440基因后发现有189个基因差异表达,其中130个基因上调表达差异达到两倍以上,59个基因下调表达差异达到50%以上。对差异表达基因进行分析,发现涉及到细胞分裂、细胞周期和调亡的相关基因表达的上调或者下调;影响信号通路相关基因的改变;还有药物耐受、组蛋白、离子通道、DNA损伤刺激和DNA修复有关的基因等表达改变。(8)通过验证TRAF6的mRNA的表达,结果证实与基因芯片结果类似,提示沉默后HepG2细胞中TRAF6表达下降。结论:(1)成功地构建了Pgenesil-1-BC047440-siRNA真核表达载体,将之转染到HepG2细胞中可有效降低BC047440蛋白的mRNA的表达水平,抑制率最高达80.22%,提示可有效沉默BC047440基因;(2)沉默HepG2细胞中的BC047440基因后,可以明显抑制HepG2的增殖,和我们前期研究结果一致;(3)BC047440基因促进HepG2细胞的增殖的调节机制之一可通过NF-κB信号途径实现,通过增加NF-κB活性促进HepG2细胞的增殖。(4)沉默BC047440基因后基因芯片检测的相关基因谱表达改变结果提示BC047440基因在HepG2细胞中参与多种生命活动,PCR验证实验提示BC047440基因可能通过改变TRAF6表达激活NF-κB信号途径,间接调节NF-κB信号途径而调控肝癌增殖。