背景:缺血/再灌注是临床上一项重大地挑战,尤其发生在胃肠道上。肠道是对缺血最敏感的组织器官之一。肠缺血/再灌注(intestinal ischemia reperfusion,I/R)损伤作为外科危急重症,常见于严重的创伤,感染,休克。随着近年来研究的深入,肠道被认为是诱发多功能脏器衰竭的因素。肠缺血/再灌注损伤后,不仅可以引起肠组织的局部损害,而且由于肠屏障功能障碍将会进一步导致细菌和毒素移位到体内循环,引起网状内皮系统发生系列反应,促炎症细胞因子大量释放入血,并进一步在循环系统弥散,导致毒血症、休克等,继而损害肝、肺、肾等多个器官,最终导致患者死亡。近年来,尽管在缺血/再灌注损伤的防治和机制研究中已经取得了很大的进展,但如何有效地预防和减轻缺血/再灌注损伤仍然是临床工作者们面临的重要难题。有研究表明氧化应激和线粒体功能障碍在缺血/再灌注损伤中发挥了重要作用。线粒体DNA(mtDNA)易受到氧化应激损伤。但缺血/再灌注损伤与mtDNA之间的关系尚不明确。MitoQ是目前研究最多和应用最广泛的线粒体靶向抗氧化剂。由TPP+与辅酶Q10的苯醌部分通过一个十碳脂肪链共价结合构成。近年来研究证实MitoQ在不断地清除过氧化氢、过氧亚硝酸盐、超氧化物,保护线粒体对抗脂质过氧化。对于MitoQ在缺血/再灌注的作用并不明确。本研究旨在探讨mtDNA损伤在肠缺血/再灌注致肠屏障功能损伤的研究,以及MitoQ保护mtDNA减轻肠屏障功能破坏的作用机制。方法:1、小鼠肠缺血/再灌注损伤模型:结扎肠系膜上动脉,30min后打开结扎部位让肠黏膜重新获得血液灌注并持续6h。IEC-6细胞缺血/再灌注的体外模型:将IEC-6细胞缺氧6h,复氧14h。为了验证肠缺血/再灌注能引起mtDNA的氧化损伤,通过免疫荧光的方法来检测IEC-6细胞中8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG),通过线粒体的红色荧光探针Mitotracker Red来标定IEC-6细胞中的线粒体,观察8-OHdG是否与线粒体重合。同时,通过实时荧光定量PCR来检测小肠组织及IEC-6细胞中mtDNA拷贝数及mtDNA基因转录水平的变化。2、为了明确在上述缺血/再灌注动物模型和细胞模型中是否存在线粒体功能障碍,通过试剂盒对肠组织及IEC-6细胞中的ATP进行检测。同时,还通过荧光探针JC-1对IEC-6细胞线粒体膜电位进行检测。3、为了明确MitoQ是否能够通过保护mtDNA来减轻小鼠肠缺血/再灌注引起的肠黏膜损伤。通过免疫荧光、western blot来检测肠屏障紧密黏膜蛋白的形态及表达。HE染色通过chiu’s评分评价肠道损伤程度。通过Tunel染色检测肠组织及IEC-6细胞中凋亡细胞的比率。对H9c2细胞进行Annexin V/PI共染色,然后经流式细胞仪分析其中凋亡细胞的比率。同时,为了明确MitoQ对mtDNA以及线粒体功能的保护作用,也检测了 H9c2细胞中8-OHdG的含量,mtDNA拷贝数,mtDNA基因转录水平,线粒体膜电位以及细胞中ATP水平。4、为了探讨MitoQ减轻mtDNA损伤的机制,对肠组织及IEC-6细胞中的MDA,GSH-x,ROS以及线粒体内超氧化物含量进行了检测。结果:1、在缺血/再灌注实验中都发现,缺血/再灌注导致了 8-OHdG的大量生成,且大部分与线粒体重合。PCR的结果提示mtDNA拷贝数和基因转录水平均明显降低。这些结果表明肠缺血/再灌注损伤与mtDNA损伤有关;2、动物实验和细胞实验都证实,缺血/再灌注导致细胞内ATP水平明显降低。细胞实验证明,缺血/再灌注后IEC-6细胞线粒体膜电位明显降低。这些结果表明缺血/再灌注引起了细胞线粒体功能障碍;3、MitoQ预处理能使小鼠肠缺血/再灌注后的肠道粘膜损伤及肠屏障功能得以改善。在细胞实验中MitoQ能明显抑制缺氧/复氧导致的细胞死亡。在细胞实验中都证明,MitoQ能使Tunel阳性的细胞数减少,使Annexin V染色阳性的细胞比率降低,表明MitoQ能够抑制缺血/再灌注引起的细胞凋亡。同时,在动物实验和细胞实验中都发现MitoQ能够有效的防止缺血/再灌注引起的8-OHdG的生成以及mtDNA拷贝数与mtDNA基因转录水平的下降。MitoQ还防止了缺血/再灌注引起的ATP水平的降低和线粒体膜电位的下降。此外,MitoQ还进一步保护了缺血/再灌注引起的肠屏障的损伤。这些结果表明MitoQ可以通过保护mtDNA,减轻线粒体功能障碍,抑制细胞凋亡,保护肠屏障功能来减轻小鼠肠缺血/再灌注损伤;4、mtDNA特别容易受到氧化应激损伤。MitoQ能够明显抑制缺血/再灌注引起的MDA、以及活性氧的生成。结论:本实验研究结果表明:mtDNA损伤在小鼠肠缺血/再灌注损伤中发挥了重要的作用;MitoQ可通过保护mtDNA减轻小鼠肠缺血/再灌注所致的肠黏膜损伤,其保护mtDNA的作用可能与其减轻线粒体氧化应激。