自身免疫性溶血性贫血(autoimmune hemolytic anemia,AIHA)/Evans综合征是由于机体免疫功能紊乱产生自身抗红细胞和/或抗血小板抗体为主的自身免疫性疾病。我们的前期研究发现B淋巴细胞的数量与AIHA/Evans综合征患者的病情严重程度呈正相关[1]。另有实验表明通过诱导CD5~+B淋巴细胞的凋亡,下调B淋巴细胞的活性可以使免疫性血细胞减少症患者的临床症状得以改善。AIHA/Evans综合征患者B淋巴细胞的凋亡状态如何?与健康对照B淋巴细胞的凋亡有无区别?其增殖能力如何以及与健康对照有无区别?本论文拟检测不同疾病状态的AIHA/Evans综合征患者及健康对照者外周血CD19~+B淋巴细胞凋亡蛋白Bcl-2,Bcl-xl的表达,caspase-3酶的活性及CD19~+B淋巴细胞凋亡细胞比例;同时检测以上患者CD19~+B淋巴细胞的增殖功能及代谢状态,并分析以上检测指标与临床指标的相关性。因此,本论文从AIHA/Evans综合征患者CD19~+B淋巴细胞的凋亡、增殖和能量代谢三方面进行研究。第一部分AIHA/Evans综合征患者CD19~+B淋巴细胞的凋亡及其临床意义目的:了解AIHA/Evans综合征患者外周血CD19~+B淋巴细胞的凋亡水平方法:研究对象为AIHA/Evans综合征(溶血组25例,缓解组15例)患者及14例健康对照者,FCM检测外周血B1淋巴细胞及B2淋巴细胞bcl-2,bcl-xl的表达及CD19~+B淋巴细胞的凋亡数量。免疫磁珠分选外周血CD19~+B淋巴细胞,RT-PCR技术检测CD19~+B淋巴细胞内bcl-2和bcl-xl m RNA的表达水平。酶标仪检测CD19~+B淋巴细胞caspase-3酶的活性,并分析上述检测指标与临床指标的相关性。结果:1、溶血组CD19~+CD5~+bcl-2~+/CD19~+CD5~+比例[(17.40±25.02)%]低于缓解组[(35.74±35.79)%],但高于健康对照组[(16.48±30.31)%],三组间比较均无统计学差异(P>0.05)。溶血组CD19~+CD5~+bcl-2~+/CD19~+比例[(0.73±1.62)%]与缓解组[(1.41±2.14)%]和健康对照组[(1.39±2.74)%]间无差异(P>0.05)。AIHA/Evans综合征患者CD19~+CD5~+bcl-2~+/CD19~+比例[(0.98±1.84)%]显著低于健康对照组[(1.39±2.74)%],差异具有统计学意义(P<0.01)。溶血组CD19~+CD5~+bcl-2~+/CD19~+比例与Ig E(r=0.6202,P=0.0046)呈正相关。缓解组CD19~+CD5~+bcl-2~+/CD19~+CD5~+比例与TBIL(r=0.6997,P=0.0037)、DBIL(r=0.6183,P=0.0140)、IBIL(r=0.7256,P=0.0022)、ret%(r=0.5206,P=0.0466)、嗜酸细胞绝对值(r=0.6022,P=0.01725)呈正相关。2、溶血组CD19~+CD5-bcl-2~+/CD19~+CD5-比例[(16.71±22.69)%]低于缓解组[(28.65±19.49)%]和健康对照组[(21.36±25.81)%],差异无统计学意义(P>0.05)。溶血组CD19~+CD5-bcl-2~+/CD19~+比例[(8.33±20.54)%]低于缓解组[(14.58±14.75)%]和健康对照组[(10.93±20.17)%],无统计学差异(P>0.05)。溶血组CD19~+CD5-bcl-2~+/CD19~+比例与DBIL(r=0.4134,P=0.0447)呈正相关,与Hb(r=-0.4000,P=0.0478)呈负相关。溶血组CD19~+CD5-bcl-2~+/CD19~+CD5-比例与Hb(r=-0.4530,P=0.0230)呈负相关。缓解组CD19~+CD5-bcl-2~+/CD19~+比例与TBIL(r=0.6989,P=0.0037)、DBIL(r=0.5966,P=0.0189)、IBIL(r=0.7478,P=0.0013)、Ret%(r=0.7829,P=0.0006)、Ret绝对值(r=0.6255,P=0.0126)呈正相关,与C4(r=-0.7218,P=0.0281)、RBC(r=-0.6391,P=0.0103)呈负相关。3、溶血组CD19~+B淋巴细胞内bcl-2 m RNA的表达(1.19±1.46)高于缓解组(1.11±1.50)和健康对照组(0.22±0.17),但低于CLL组(4.08±1.75),差异无统计学意义(P>0.05);CLL组bcl-2 m RNA的表达显著高于健康对照组(P<0.05),差异具有统计学意义。4、溶血组CD19~+CD5~+bcl-xl~+/CD19~+CD5~+比例[(12.79±29.14)%]高于缓解组[(5.14±13.97)%],低于健康对照组[(15.94±10.56)%],差异无统计学意义(P>0.05)。溶血组CD19~+CD5~+bcl-xl~+/CD19~+比例[(1.87±7.30)%]高于缓解组[(0.01±0.03)%],低于健康对照组[(1.36±4.10)%],两组间差异无统计学意义(P>0.05)。5、溶血组CD19~+CD5-bcl-xl~+/CD19~+CD5-比例[(1.05±3.87)%]高于缓解组[(0.02±0.06)%]和健康对照组[(0.96±2.96)%],差异无统计学意义(P>0.05)。溶血组CD19~+CD5-bcl-xl~+/CD19~+比例[(1.05±3.87)%]高于缓解组[(0.01±0.03)%]和健康对照组[(0.49±1.84)%],各组间差异无统计学意义(P>0.05)。6、溶血组CD19~+B淋巴细胞内bcl-xl m RNA的表达(2.71±6.15)高于缓解组(2.27±2.97)和健康对照组(0.89±0.29),低于CLL组(3.45±2.97);各组间相比均无统计学意义(P>0.05)。7、溶血组CD19~+CD5~+凋亡细胞比例[(20.16±26.26)%]高于缓解组[(8.41±10.13)%]和健康对照组[(5.24±5.71)%],溶血组与健康对照组间有统计学差异(P=0.05)。溶血组CD19~+CD5-凋亡细胞比例[(1.77±4.19)%]高于缓解组[(1.57±4.43)%]和健康对照组[(1.48±1.38)%]。溶血组CD19~+CD5~+凋亡细胞比例高于CD19~+CD5-凋亡细胞,且差异有统计学意义(P=0.004),而缓解组和健康对照组CD5~+和CD5-B淋巴细胞的凋亡无统计学差异(P>0.05)。溶血组CD19~+B淋巴细胞的凋亡与DBIL(r=0.6756,P=0.0021)呈正相关、CD19~+CD5-B淋巴细胞的凋亡与DBIL(r=0.6665,P=0.0025)呈正相关,与其他临床指标无相关性。8、AIHA/Evans综合征患者CD19~+B淋巴细胞caspase-3的酶活性(23.32±21.76)低于健康对照组(54.01±13.71,P=0.026),差异具有统计学意义。且与TBIL(r=-0.9061,P=0.0128),DBIL(r=-0.8239,P=0.0438),IBIL(r=-0.9249,P=0.0082)呈负相关。结论:AIHA/Evans综合征患者CD19~+B淋巴细胞的bcl-2及bcl-xl的表达水平高于健康对照,其晚凋亡细胞比例高于健康对照,caspase-3酶活性低于健康对照,提示AIHA/Evans综合征患者CD19~+B淋巴细胞功能亢进。第二部分AIHA/Evans综合征患者CD19~+B淋巴细胞的增殖及其临床意义目的:了解AIHA/Evans综合征患者CD19~+B淋巴细胞的增殖功能及其临床意义。方法:研究对象为AIHA/Evans综合征患者9例,健康对照6例。磁珠分选CD19~+B淋巴细胞,CCK-8方法检测CD19~+B淋巴细胞的增殖能力,并分析其与临床指标的相关性。结果:AIHA/Evans综合征患者CD19~+B淋巴细胞增殖的OD值(0.17±0.03)高于健康对照组(0.10±0.01),差异有统计学意义(P=0.001)。结论:AIHA/Evans综合征患者CD19~+B淋巴细胞的增殖能力高于健康对照组。第三部分AIHA/Evans综合征患者CD19~+B淋巴细胞的代谢及其临床意义目的:检测AIHA/Evans综合征患者外周血B1淋巴细胞及B2淋巴细胞PKM2的表达,了解AIHA/Evans综合征患者外周血CD19~+B的代谢水平及其临床意义。方法:研究对象为AIHA/Evans综合征(溶血组11例,缓解组8例)患者及10名健康对照者,FCM检测外周血B1淋巴细胞及B2淋巴细胞PKM2的表达,并分析其与临床指标的相关性。结果:1.溶血组CD19~+CD5~+PKM2~+/CD19~+CD5~+比例[(83.17±30.87)%]与缓解组[(76.41±37.31)%]和健康对照组[(77.34±30.08)%]相比无差异(P>0.05)。溶血组CD19~+CD5~+PKM2~+/CD19~+比例[(5.26±11.64)%]高于缓解组[(1.83±2.75)%]和健康对照组[(2.09±1.69)%],但三组均无统计学差异(P>0.05)。溶血组CD19~+CD5~+PKM2~+/CD19~+细胞的比例与RBC、Ig E、Ig A和呈正相关,与其他临床指标无相关性。2.溶血组CD19~+CD5-PKM2~+/CD19~+CD5-细胞的比例[(75.42±29.48)%]高于缓解组[(66.20±41.45)%]和健康对照组[(56.58±30.07)%],各组间差异无统计学意义(P>0.05)。溶血组CD19~+CD5-PKM-2~+/CD19~+比例[(69.13±35.45)%]高于缓解组[(64.99±40.83)%]和健康对照组(52.98±31.25)%],均无统计学差异(P>0.05)。3.PKM2在CD5~+B淋巴细胞中的表达在溶血组,缓解组及健康对照组中均较CD5-B淋巴细胞低,且三组间差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:AIHA/Evans综合征溶血患者CD19~+B淋巴细胞PKM2的表达水平高于缓解组及健康对照组,提示PKM2可通过多种途径促进AIHA/Evans综合征患者CD19~+B淋巴细胞的增殖。