目的:神经管畸形（Neural tube defects,NTDs）是中枢神经系统最常见的先天性缺陷。手术治疗仅能修复组织缺损,但是对于神经功能的修复效果不佳。而细胞治疗既能够修复组织缺损又能进行神经元重建。我们课题组前期实验在NTDs大鼠的胚胎中移植骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）,发现定植于缺损部位的BMSCs中有约20%分化为神经元。广泛认为,越高的神经元分化意味着神经损伤修复和功能恢复越好。为了获得更好的细胞治疗效果,我们探索提高BMSCs向神经方向分化的新方法。外泌体（exosomes）是由细胞分泌的双层包裹的小囊泡,含有其来源细胞的成分,因而具有其来源细胞的功能特征。神经干细胞（Neural stem cells,NSCs）具有自我更新和分化为神经元及神经胶质细胞的能力,因此我们推测神经干细胞源外泌体可能携带某些特异性的功能分子,诱导BMSCs向神经方向分化,从而揭示脊髓微环境对于BMSCs向神经元分化导向作用的机制,同时利用神经干细胞源外泌体提高NTDs细胞治疗时移植的BMSCs向神经元分化的效率,进而改善治疗效果。研究方法:利用Lable free质谱技术,检测神经干细胞源外泌体、NSCs、BMSCs的蛋白质谱。通过GO分析,查找神经干细胞中具有促神经元分化功能的蛋白。利用Western Blot方法验证候选蛋白质在神经干细胞源外泌体、NSCs、BMSCs表达水平的差异。利用蛋白质组学筛选出的Netrin1（500ng/ml）诱导NSCs分化,并利用免疫荧光染色和Western Blot检测神经元标志物Map2、NF、β3-Tubulin的表达。在GEO数据库中检索到Netrin1相关的数据集GSE54107。利用生物信息学方法筛选表达上调并且具有促进神经元分化功能的分子。利用RNAi技术与Western Blot验证,在Netrin1作用下,NSCs中Netrin1下游功能分子蛋白表达水平的变化,并阻断该分子,观察Map2、NF、β3-Tubulin蛋白表达水平的改变。BMSCs培养基中分别添加神经干细胞源外泌体及500ng/ml Netrin1,检测Map2、NF、β3-Tubulin的表达。并且对全胚胎培养（whole embryo culture,WEC）的脊柱裂胎鼠羊膜腔内单纯注射BMSCs或联合注射BMSCs与神经干细胞源外泌体,检测定植BMSCs中β3-Tubulin阳性细胞百分率的差异。数据以均值±标准差表示,采用SPSS22.0软件对实验数据进行t检验和单因素方差分析,以p值表示统计差异,p<0.05认为差异具有统计学意义。结果:⒈Lable free质谱检测神经干细胞源外泌体、NSCs、BMSCs的蛋白质谱结果。⑴神经干细胞源外泌体、NSCs、BMSCs的蛋白质谱全GO分析的结果显示,神经干细胞源外泌体中细胞外基质成分比例高于NSCs。⑵神经干细胞源外泌体相对于NSCs上调蛋白的GO分析结果显示,外泌体富集了具有调节NSCs分化功能的蛋白。⑶神经干细胞源外泌体全GO注释结果显示有30个蛋白在GO注释中为阳性调节神经元分化（GO:0045666）。质谱检测结果显示在30个蛋白中Netrin1、Nedd4l、Ptprz1、Fn1在神经干细胞源外泌体中表达水平高于NSCs,Pafah1b1、Camk2d、Gsk3b、Prpf19、Netrin1、Rufy3、Camk2b、Ptprz1、Reelin在神经干细胞源外泌体中蛋白表达水平高于BMSCs。⑷Western Blot验证结果显示与其来源细胞NSCs相比,Netrin1、Nedd4l富集表达于神经干细胞源外泌体中（p=0.0007、p<0.0001）,并且表达水平高于BMSCs（p=0.0004、p<0.0001）。⒉Netrin1诱导NSCs向神经元分化的实验结果。⑴500ng/ml Netrin1培养的小鼠NSCs中β3-Tubulin的阳性率高于对照组的（p<0.0001）,并且Map2、NF、β3-Tubulin蛋白水平表达上调（p=0.0068、p=0.0112、p=0.002）。⑵对Netrin1诱导i PS的RNA测序数据集GEO54107进行GO分析,在神经嵴分化（GO:0014033）功能注释下,筛选到Phox2b、Hand2、Wnt10a。PPI分析结果显示Hand2与Phox2b存在相互作用。⑶500ng/ml Netrin1培养的小鼠神经干细胞中,Phox2b、Hand2蛋白表达水平升高（p=0.0013、p=0.0023）,并且利用RNAi下调Phox2b在给予500ng/ml Netrin1诱导NSCs分化,Map2、NF、β3-Tubulin蛋白水平明显低于NC+500ng/ml Netrin1组（p=0.0001、p=0.0003、p=0.0002）。⒊体外神经干细胞源外泌体、Netrin1诱导BMSCs向神经元分化的实验结果,以及体外羊膜腔联合移植BMSCs与神经干细胞源外泌体治疗NTD胎鼠的实验结果。⑴神经干细胞源外泌体诱导BMSCs向神经元分化明显增多,β3-Tubulin阳性细胞的百分比明显高于对照组（p=0.0138）。并且神经干细胞源外泌体组中,Map2、NF、β3-Tubulin的蛋白表达水平明显上调（p=0.0033、p=0.0009、p=0.028）。⑵500ng/ml Netrin1诱导BMSCs向神经元分化明显增多,β3-Tubulin阳性细胞的百分比明显高于对照组（p<0.0001）。500ng/ml Netrin1诱导BMSCs中神经元标志物Map2、NF、β3-Tubulin蛋白表达水平明显升高（p=0.0001、p=0.0064、p=0.0061）。⑶在全胚胎培养的大鼠神经管畸形模型中,神经干细胞源外泌体与BMSCs联合治疗组的BMSCs的神经元分化率明显高于单纯BMSCs组（p<0.0001）。结论:1.神经干细胞源外泌体中携带30个促神经元分化的蛋白质,并对其中Netrin1、Nedd4l存在富集作用。2.胞外基质Netrin1能够通过上调Hand2、Phox2b促进神经干细胞向神经元分化。3.神经干细胞外泌体及外泌体中富集的Netrin1均能诱导BMSCs向神经元分化,并且能够提高NTDs细胞移植治疗时BMSCs向神经元分化的效率。