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研究目的:兴奋剂问题一直以来都是困扰所有体育赛事的主要问题之一,世界反兴奋剂机构禁止在一切运动赛事中使用兴奋剂。然而对于兴奋剂的有效检测却远远落后于兴奋剂的研发与使用。本实验通过研究基因兴奋剂IGF-Ⅰ,建立一种检测区分内、外源基因表达的方法,为基因兴奋剂的有效检测提供理论依据。研究方法:本实验采用r AAV2介导IGF-Ⅰ的方法将外源基因注射进入小鼠肌肉,用以检测区分内、外源基因的表达情况。研究对象为30只雄性ICR小鼠,随机分为空白对照组(n=6)、注射3d组(n=6)、注射7d组(n=6)、注射14d组(n=6)、注射30d组(n=6)。构建含有目的基因IGF-Ⅰ的质粒,并进行病毒包装。在小鼠右侧后肢膝关节上方斜行进针进行病毒注射,每组按照不同的实验天数分别提取肌肉和血液中的DNA。通过在IGF-Ⅰ基因序列外显子2,3之间设计特异性的荧光探针来识别外源性IGF-Ⅰ基因,合成ITC基因以及相应的ITC探针,作为实验内部阈值调控的模版。以肌肉和血液提取得到的样本DNA为模板进行实时荧光定量PCR,实验过程中样本DNA、ITC质粒、IGF-Ⅰ目的探针、ITC探针、引物等放在同一体系中反应。实验结束后通过比较IGF-Ⅰ目的探针与ITC探针Ct值的大小,来排除实验过程中外界因素的干扰。通过比较相应组别的Ct值,来确定IGF-Ⅰ的表达。实验结果采用Excel与SPSS17.0统计软件进行分析。研究结果:(1)在实时荧光定量PCR过程中,通过实验仪器能够捕捉到目的探针荧光信号的积累,说明实验过程中注射的外源性IGF-Ⅰ在小鼠体内得到表达,本实验设计的方法,能够检测到外源基因的表达。(2)不同时间获取肌肉,提取DNA进行PCR,实验结果显示随着实验天数的增多Ct值逐渐增大,且3d组与7d组之间Ct值升高明显,14d组与30d组之间Ct值升高趋于缓慢;不同时间获取血液,提取DNA进行PCR,实验结果显示随着实验天数的增多Ct值变化的趋势不明显,但二者Ct值均小于空白对照组Ct值。(3)分别以肌肉和血液提取DNA为模版进行PCR,在3d,7d组,肌肉DNA的Ct值小于血液DNA的Ct值,两者之间差异显著(P<0.01)。14d,30d组,肌肉DNA的Ct值大于血液DNA的Ct值,且两者之间差异显著(P<0.01)。(4)以不同取材量肌肉、血液提取DNA为模版进行PCR,实验结果显示,不同取材量PCR后的Ct值两者之间没有显著性的差异(P>0.05)。研究结论:(1)本实验建立的方法能有效的检测区分内、外源IGF-Ⅰ的表达。(2)不同取材时间对肌肉的检测结果有显著影响,对血液的检测结果没有影响。(3)不同取材组织对检测结果有较大影响。本实验结束显示,基因注射后7天内肌肉检测比血液检测更稳妥,注射7天后血液检测比肌肉检测更有利。(4)不同取材量对实验检测的结果没有影响。