【摘 要】
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紫色紫孢菌(Purpureocillium lavendulum,原名淡紫拟青霉,Paecilomyces lilacinus)是目前已实现商品化的线虫生防真菌。本研究以紫色紫孢菌YMF1.00683为出发菌株,首先利用同
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紫色紫孢菌(Purpureocillium lavendulum,原名淡紫拟青霉,Paecilomyces lilacinus)是目前已实现商品化的线虫生防真菌。本研究以紫色紫孢菌YMF1.00683为出发菌株,首先利用同源重组的方法对ku80基因进行敲除以及回补。之后对ku80敲除菌株、回补菌株的形态和毒力进行测定,在确定ku80敲除菌株与野生型菌株具有同样杀虫效果后,以野生型菌株、ku80敲除菌株、ku80回补菌株分别为出发菌株,对基因brlA进行敲除,并比较在这三株菌株为敲除背景的条件下brlA的敲除效率。本研究为紫色紫孢菌进行高效基因敲除奠定了基础。主要研究结果:1.构建了紫色紫孢菌ku80基因的敲除与回补菌株酶切质粒pPK2-neo-GFP,经过In-fusion连接使其筛选标记neo(新霉素磷酸转移酶编码基因)两端连接有ku80基因上下游同源片段。将构好的敲除载体通过农杆菌介导转化紫色紫孢菌,通过同源重组使紫色紫孢菌基因组上的ku80基因用neo基因替换,以G418筛选转化子,通过PCR与Southern blot的方法验证获得的ku80敲除菌株。再同样酶切质粒pPK2-bml-GFP,将ku80全长基因连接在筛选标记bml(抗杀菌剂苯菌灵基因)后,构建的回补载体经农杆菌介导转化至ku80敲除菌株中,以苯菌灵筛选转化子,通过PCR和Southern blot的方法验证获得的ku80回补菌株。2.ku8 敲除和回补菌株与野生型菌株的生长和杀线虫能力一致通过观察和统计,表明这三株菌株的菌落形态、生长速率表现出一致性,同时通过ku80敲除和回补菌株以及野生型菌株对C.elegans的侵染效果的比较,确定ku80敲除和回补菌株对线虫具有与野生型菌株同样的毒力,因此ku80敲除株可用做后续研究的背景菌株。3.敲除ku80基因提高紫色紫孢菌的的同源重组效率利用浙江大学方卫国教授改进后的OSCAR技术,构建brlA敲除载体,通过农杆菌介导分别转化至紫色紫孢菌野生型、ku80敲除和回补菌株中,通过对brlA敲除效率以及将同课题组构建的wetA、abaA基因敲除载体同样转化至这三株菌种的敲除效率进行比较之后,确定敲除ku80基因后能够提高其他基因的基因打靶频率。本论文的主要创新点:首次在紫色紫孢菌中破坏导致基因打靶效率低下的非同源重组末端修复(NHEJ)途径以提高基因打靶频率,具体操作即通过对ku80基因的敲除破坏NHEJ途径中至关重要的Ku蛋白复合体的正常形成,使得同源重组发生概率提高。
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