禽流行性感冒,简称禽流感(Avian Influenza,AI),是由正粘病毒科、正粘病毒属A型流感病毒所引起的禽类的感染和/或疾病综合征。自1994年首次报道H9N2亚型禽流感在中国的流行以来,已有多位学者先后从不同地区的患病鸡群中分离到相同亚型的禽流感病毒。从已有的报道分析,H9N2亚型禽流感病毒已成为中国当前禽流感病毒的主型,并且对养禽业的危害越来越严重,尤其是它与公共卫生方面的某些联系,更激起了人们对它的广泛兴趣。鉴于HA基因在病毒吸附、穿膜过程以及病毒的致病力方面均起着关键作用,开展对H9N2亚型禽流感病毒的HA基因变异分析及对其免疫抑制作用的研究,无论在病毒学还是兽医学方面均有重要的意义。1、H9N2亚型禽流感病毒的分离、鉴定及HA基因变异分析本试验采集了2007-2010年山东省泰安、潍坊、烟台等12个地区35个商品代肉鸡鸡场不同季节疑似H9N2亚型流感病毒感染的500多份病料,进行了病毒的分离、鉴定,并对分离所得的12株病毒进行了HA基因测序及序列分析。结果表明不同地区所分离的12株禽流感病毒同源性较高,核苷酸同源性在91.5-99.9%之间,氨基酸同源性在90.6%-100%之间。HA基因序列比对结果显示,与2007年福建分离株和1999年山东分离株同源性均较高,核苷酸同源性分别为93.2%-96.9%和92.4%-99.5%,推导氨基酸序列同源性分别为91.2%-98.6%和87.8%-99.1%。与国外分离株亲缘关系较远,如2000、2003、2008韩国分离株、2002年伊朗和沙特阿拉伯分离株、2004年北印度和西印度分离株等,其中与2008年韩国分离株亲缘关系最远,核苷酸同源性仅为81.1%-83.3%,推导氨基酸序列同源性为74.5%-85.1%。同时,12株分离株与EU939143 2007年山东H9N2亚型流感病毒分离株进行了同源性比对,核苷酸和氨基酸同源性分别为90.2%-94.5%和87.3%-94.8%,此株病毒与欧亚代表毒株C/BJ/1/94同源性93.4%。系统进化树分析结果表明,12株分离株与07山东分离株同属于欧亚种系中的类CKBJ1/94亚系。12个毒株的裂解位点(335-341aa)的氨基酸序列均为RSSR↓GLF,符合低致病性禽流感裂解位点的氨基酸序列特征。但是核苷酸分析表明,有3个分离毒株的337位为丝氨酸,其相应的核苷酸分别为AGT和AGC,它们都有可能突变为AGA,即丝氨酸变为精氨酸,从而使裂解位点成为高致病性禽流感病毒的特征序列(RPK-X-K/R-R)。5株分离株234位受体结合位点由Q变异为L,与香港人源H9N2毒株此处氨基酸相同,但是第226位受体结合位点为Q,不易感染人。2、H9N2亚型禽流感病毒对鸡免疫机能的影响选择毒假中等的H9N2亚型禽流感病毒SD06分离株对SPF鸡进行了攻毒试验,探讨H9N2亚型禽流感病毒SD06株对鸡免疫机能的影响。首先将200只SPF鸡随机均分为A、B两组,隔离饲养。A攻毒组,B为不接种病毒对照组。B组于8日龄经点眼滴鼻人工感染H9N2亚型禽流感病毒SD06株,攻毒剂量为0.4 mL/只(EID50为10-7.38 /0.1mL)。攻毒后7、14、21、28、35d ,A、B两组随机选取10羽,剖杀采集气管、肺脏、脾脏等组织,利用荧光定量RT-PCR方法检测H9N2禽流感病毒在不同组织、不同时间在感染鸡中的载量及复制情况。攻毒后每隔4 d随机剖杀5只,采集肺脏、脾脏、法氏囊、肾脏、胰腺、脑等组织固定,常规H.E.染色观察免疫器官的病理变化,并利用间接免疫荧光染色对病毒进行抗原定位。同时在攻毒后7、14、21、28、35d随机抽取10羽称取活重,采集血样,进行Annexin V-FITC/PI标记,利用流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群及细胞凋亡、P53和Bcl-2 mRNA表达水平情况;剖检分离胸腺、法氏囊、脾脏并称重,计算免疫器官指数。然后将另外200只鸡随机分成C(C1、C2、C3)、D四组,在14d和21d免疫新城疫疫苗,C1、C2、C3为不同剂量攻毒组,攻毒剂量分别为0.2 mL/只、0.4 mL/只、0.6 mL/只,于8日龄攻毒,攻毒后7、14、21、28、35d,随机取10羽采集血样,分离血清,测定血清中抗NDV血凝抑制抗体滴度,绘制抗体消长曲线,了解流感病毒对新城疫疫苗抗体水平的影响。SPF鸡于攻毒后3d开始发病,发病鸡表现体温升高、精神沉郁,前期流浆液性带泡沫的眼泪,后期流黄白色脓性分泌物等症状。部分鸡心冠脂肪、肺脏、脾脏等可见出血点。采用SYBR Green I嵌合型荧光染料与双链DNA结合后发出荧光,通过检测反应体系中荧光强度,表明攻毒后7-14 d以气管中病毒含量最高,随后21 d后肺脏以及脾脏中的病毒含量开始升高,并以肺脏中病毒含量最高。攻毒7 d后(15日龄)及14 d(22日龄),免疫器官指数下降尤为明显,病理组织学检测结果显示胸腺、法氏囊退化及脾小体的充血、出血。经荧光染色,发病鸡流式细胞术结果显示,H9N2亚型流感病毒后14d,CD4~+T细胞及CD8~+T细胞均比对照组降低,CD4~+/CD8~+比值也明显下降,与对照组比较差异显著;Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况显示,攻毒后促进淋巴细胞早期凋亡;血液淋巴细胞内P53 mRNA表达水平上升,Bcl-2 mRNA表达水平下降;攻毒组抗NDV的HI抗体滴度较对照组明显下降。综上所述,近3年来山东地区分离到的H9N2流感病毒HA基因序列变异较小。对SPF鸡的相关试验研究结果表明,H9N2亚型禽流感病毒感染,可使SPF鸡免疫器官受损,免疫器官指数下降,T淋巴细胞数减少,同时还能引起血液淋巴细胞内P53 mRNA表达水平上升,Bcl-2 mRNA表达水平下降,对鸡的免疫机能造成严重的抑制作用,从而导致后期新城疫等疫苗的免疫失败。